Tomimaru Y, Eguchi H, Nagano H, et al. Circulating microRNA-21 as a novel biomarker for hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2012, 56（1）：167-175.

2b。

肝细胞癌是一种常见的癌症, 特别是在日本和其他的东亚国家, 是世界第三大的肿瘤相关死亡原因。肝细胞癌高死亡率的原因是因为肿瘤发现时, 肝内或肝外转移已经无法行切除术。在高危人群中筛查肝细胞癌的一个常用方法是血清肿瘤标志物甲胎蛋白（a-fetoprotein, AFP）和人凝血酶原前体蛋白-Ⅱ （protein induced vitamin K absence or antagonist-Ⅱ , PIVKA-Ⅱ ）相关蛋白。然而, AFP和PIVKA-Ⅱ 水平诊断肝细胞癌没有足够的敏感性和特异性。因此, 发现新的生化标志物来早期发现肝细胞癌是有意义的。多项研究已报道循环小分子核糖核酸（microRNA, miRNA）-21作为癌症新的生化标志物的意义。然而, 目前没有报道关于循环microRNA-21作为肝细胞癌新的生化标志物的意义。

评价循环microRNA-21水平作为肝细胞癌生化标志物的意义, 以及血浆miRNA-21对肝细胞癌的预后意义和调查肿瘤组织miRNA-21的表达与血浆水平的相互关系。

• 研究条件：该研究在日本大阪大学医院外科完成。

• 研究方法：采集肝细胞癌患者术前和术后血浆样本、切除的肿瘤组织及非肿瘤组织标本, 对照组（慢性肝炎和健康志愿者）采集血浆样本。

• 研究对象：大阪大学医院外科2010年1月至2010年2月10例治疗性肝切除术肝细胞癌患者, 及在2001年1月至2005年12月收治的126例连续的接受治疗性肝切除术和术后随访43.4± 25.5个月肝细胞癌患者。

• 干预措施：通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测126例肝细胞癌患者和对照病例（30名慢性肝炎和50例健康志愿者）血浆miRNA-21表达水平; 用RIzol试剂从肿瘤和非肿瘤组织中分离miRNA-21, 并用NanoDrop ND-1000分光光度计定量。

• 评价指标：miRNA-21鉴别肝细胞癌和慢性肝炎、健康志愿者的效力, 对肝细胞癌患者预后的意义。

• 肝细胞癌患者的血浆miRNA-21的表达水平明显高于慢性肝炎和健康志愿者（P< 0.000 1和P< 0.000 1）。

• 鉴别肝细胞癌和慢性肝炎, 血浆miRNA-21、AFP、两者联合的敏感性分别是59.5%、61.1%、81.0%; 同样, 在鉴别肝细胞癌患者和健康志愿者有相似的表现（血浆miRNA-21、AFP、两者联合的敏感性分别是77.8%、87.3%、92.9%）。

• 术后4年内无复发患者的血浆miRNA-21水平明显低于术后2年复发和接下来的2年内复发的患者（P=0.012 5和P=0.048 3）。

血浆miRNA-21的表达与瘤组织miRNA-21的表达明显相关, 是肝细胞癌的一个有前途的生化标志物, 其敏感性优于AFP, 两者联合的敏感性更优, 其水平与术后复发有一定相关性。

肝细胞癌是一种原发于肝脏的恶性肿瘤, 近年来肝癌发病率和死亡率一直呈现上升趋势, 其发病率居世界第5位, 死亡率则高居世界第3位, 在我国肝癌已成为恶性肿瘤相关死亡的第2位“ 杀手” ^{[1, 2]}。虽然根治性切除或肝移植可使早期肝癌患者5年生存率达到50%~70%, 但是可以获得早期诊断的肝癌患者不足40%^[3], 进展期及终末期肝癌由于缺乏有效的治疗手段, 生存率明显下降^{[2, 4]}。早期诊断方法不足以成为改善肝癌预后的重要“ 瓶颈” 之一, 寻找新的有效的诊断方法成为近年来研究的热点。AFP对于肝癌诊断的敏感性仅在40%~70%^{[5, 6]}, 联合腹部超声虽然可以提高诊断的敏感度, 但是会受到仪器设备及检查人员经验差异的影响; CT、MRI及PET-CT等新技术可以提高肝癌尤其是直径小于2 cm肝癌的诊断阳性率, 但费用昂贵, 无法作为一种普查手段。因此, 新的肝癌诊断方法必须符合简单有效、经济实用的要求。

miRNA是一类内源性表达的非编码RNA, 由20~24个核苷酸分子组成, 最早由Lee等人发表在1993年的《Cell》杂志上, 迄今为止已在人体中发现上千种miRNA。目前已知miRNA参与人体许多重要生理、病理过程, 既可以作为抑癌基因又可以作为癌基因调控信使RNA（mRNA）的表达, 与肿瘤的发生发展以及细胞的增殖、分化、凋亡等过程密切相关^{[7, 8, 9, 10]}。miRNA-21目前被认为是一种癌基因, 通过抑制PTEN、抗凋亡等途径以促进肿瘤细胞增殖、迁移、存活, 它异常表达在几乎所有类型的恶性肿瘤, 例如肝癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、头颈部肿瘤及白血病、淋巴瘤等, 有研究报道miRNA-21分子参与了肝癌细胞的分化、异常增殖、侵袭迁移等过程^[9], 基于这一特点, 许多研究将其作为一种新的肝癌分子标志物及治疗靶点^{[9, 10]}。

大阪大学医学院外科研究所Tomimaru 等发表在欧洲肝病学杂志上的这项研究提出：将血循环中的miRAN-21作为一种新的生化指标, 用于肝癌的诊断。研究严格按照诊断性试验的设计要求, 以组织病理诊断作为“ 金标准” ; 试验对象包含了各期的肝癌患者、慢性肝炎患者及健康志愿者, 入选病例的基本临床特征经过统计学检验未见明显差异, 样本均衡性较好, 降低了试验误差; 选择临床上得到普遍公认的标志物（AFP）进行对比, 采用受试者工作特征曲线法进行诊断效能检验, 并进一步使用交叉检验法验证受试者工作特征曲线下面积, 检验方法选择合理, 试验设计严密, 准确提供试验敏感度、特异度等具体数据, 可由此得出该试验的阳性似然比及验后概率, 有一定临床诊断实用价值, 是一篇质量较高的诊断性试验的文献报道。

Tomimaru 等分别对比了肝癌患者与慢性肝炎肝硬化患者、肝癌患者与健康志愿者的血浆miRNA-21水平, 结果显示肝癌患者血浆miRNA-21水平较两对照组人群显著升高, 这与相关文献报道较为一致^{[9, 10]}, 与以往研究不同的是, 本研究同时排除了临床分期、肝硬化、病毒负荷及肝功能等因素对血浆miRNA-21表达水平的影响, 提示肝癌患者的血浆miRNA-21是一个有临床意义并相对独立的因子, 为其成为新的诊断指标提供了依据。而选择AFP作为阳性对照, 则是该研究的一大亮点。关联分析显示AFP与miRNA-21相关性较小（r=0.403, P< 0.000 1）, 提示AFP与miRNA-21是肝癌诊断中两个相对独立的指标, 将两者诊断效能进行对比是可行的。研究数据显示AFP与miRNA-21的受方式者工作特征曲线下面积都达到了0.7以上, 证实二者均具有较高的诊断效能, 且对比结果显示miRNA-21更胜一筹, 为其成为新的诊断指标提供了又一证据。值得注意的是研究中入组的30例慢性肝炎患者均已发生肝硬化, 属于需要重点监测的高危人群, 但miRNA-21在区分肝癌与慢性肝炎时, 其敏感性仅为61.1%, 较AFP并无明显优势。另外, 在直径小于2 cm的肝癌中miRNA-21与AFP的诊断敏感性均只有55%, miRNA-21对小肝癌的诊断并不优于AFP。因而miRNA-21尚无法替代AFP的诊断地位。

尽管本研究证实了miRNA-21的诊断价值, 但要在实际临床工作中推广应用, 仍存在一些关键问题未能解决。本研究中Tomimaru等认为肝癌患者血浆中的miRNA-21来源于肝肿瘤组织, 依据是根治性切除肿瘤病灶10~30天后, 肝癌患者血浆中miRNA-21水平较术前显著下降。但具体分析则发现：入选病例中仍有20%（2/10）的患者术后血浆miRNA-21水平是升高的。研究者并未对这一问题作出解释, 回顾相关文献, 在动物实验中同样存在这种看似“ 反常” 的现象, 如Ng等^[11]曾报道切除小鼠2/3的肝脏, 术后18~24小时小鼠血循环中的miRNA-21呈激增状态。Ng等对这一现象的解释是：miRNA-21可以通过加快细胞周期蛋白D1的翻译, 促进肝细胞增殖从而使肝再生过程加速, 具有积极的生理功能。Tomimaru 等研究中的2例特殊情况是否也是手术刺激所致的生理性激增?仅凭目前的资料尚难以定论, 需要进一步扩大样本量研究探讨; 除此之外, 排除物种的差异, 上述两个试验的采血时间点也存在很大的跨度, 设想血浆miRNA-21浓度存在随时间变化的规律, 那么确定术后采血时间以有效监测手术疗效, 将成为下一个研究重点。

Tomimaru 等研究者不仅对miRNA-21的诊断价值及疗效监测进行了分析研究, 同时也探讨了它在预后评价方面的作用, 结果并不尽如人意。本研究中多因素分析显示肿瘤组织中的miRNA-21是一个独立预后因素, 肿瘤组织高miRNA-21水平提示预后不佳, 并与肿瘤的大小、数量、AFP浓度、脉管侵犯等密切相关; 而血浆miRNA-21与肿瘤组织miRNA-21的相关性不高（r=0.407）, 二者对预后评价方面也存在差异：血浆miRNA-21水平似乎仅对4年以上远期疗效的评估有价值, 在无进展生存期方面未体现有统计学意义的预测价值 , 因此目前是否将血浆miRNA-21作为一项预测预后的指标仍有待进一步研究论证。

综上所述, 血浆miRNA-21对于肝癌有不劣于AFP的诊断效能, 检查方式较超声、CT及MRI简便, 与AFP结合能提高肝癌临床诊断的敏感性及准确率, 有望作为一种新的标志物应用于临床, 尤其对于AFP阴性的肝癌患者或高危人群, 检测血浆miRNA-21可能是一种有效的监测方式。但是miRNA-21可以在多种恶性肿瘤中表达, 在判断肿瘤原发灶方面存在其局限性, 需要配合其他肿瘤标志物及影像学手段; 借鉴AFP联合腹部超声在肝癌诊断中的有效经验, 下一步可以研究miRNA-21与腹部超声或联合或序贯的方式, 探讨二者联合在肝癌早期诊断中的作用价值; 此外, 如Zhou等^[10]研究所述肝癌患者的血浆中至少有7种miRNA分子与肝癌的诊断密切相关, miRNA-21是否为其中最佳的标志物仍需要进一步对比研究。