为了进一步推动中国肺癌临床研究的发展, 中国临床肿瘤学会和中国抗癌协会肺癌专业委员会于2016年3月4-5日在广州举行了第十三届中国肺癌高峰论坛。此次会议的主题是“ 规范与精准同行：液体活检和二代测序步入临床” , 来自全国各地从事肺癌和相关学科研究的500多位专家和学术带头人参加了此次会议。

十余年来, EGFR和ALK等分子靶点的发现和相应靶向药物的应用拉开了肺癌精准治疗的序幕。为进一步优化靶向治疗并探寻新的治疗靶点, 液体活检和二代测序（next generation sequencing, NGS）技术已成为肺癌研究的焦点。但是, 液体活检与NGS技术的合理应用仍然存在诸多问题, 液体活检能否完全替代组织活检, 指导临床用药?液体活检能否用于动态监测疗效?当液体活检与组织活检结果不一致时, 如何抉择?NGS能否替代单基因检测?如何合理高效应用NGS?近年来已有一些研究在尝试回答这些问题, 然而, 我们对液体活检和NGS这两项新技术在临床实践中的真正价值和合理应用仍需更多的探索。 因此, 此次论坛针对众多液体活检和NGS领域具有争议的话题, 设置了“ 规范与精准同行：液体活检和二代测序步入临床” 这一论坛主题。旨在汇集国内肺癌及相关学科的专家和学术带头人, 多学科地讨论液体活检和NGS在肺癌诊治领域的规范合理应用问题, 与会的不同学科的专家们从各自专业的角度发表了看法、倾听相关学科的意见。会议期间本刊编辑部记者专题采访了几位专家。

记者：揣博士, 液体活检和NGS技术已成为肺癌研究的焦点, 请您先给我们介绍一下近年来NGS的技术发展和应用情况。

揣少坤博士（广州燃石医学检验所有限公司）：我们认为NGS这项技术近年来取得了很大的进步, 并显示出非常大的应用价值。因为NGS不仅可以发现有价值的基因突变, 而且可以解决传统检测方法面临的问题, 已被多部指南推荐应用。

所谓有价值的基因突变, 应达到两方面的要求：首先是能定性、定量准确检测, 不仅可以定性地检测出基因突变, 而且可以定量地检测出基因突变亚克隆在肿瘤中的占比。 第二是有用, 可检测不同临床应用目的的“ 有用” 基因变异。

全基因组包含了2万多个基因, 大多数基因位点的临床意义是未知的, 哪些是临床转化中真正有用的基因是要思考的问题。肺癌是体现NGS价值的最佳领域, 因为肺癌、乳腺癌和甲状腺癌等少数癌种的基因驱动非常强烈, 它们的诊断、治疗和预后可以通过DNA层面的变异进行关联和预测, 在这些肿瘤中NGS可体现其丰富的价值。肺癌是所有癌种中靶向药物选择最多的肿瘤, 当我们的检测技术进入临床时, 检测出的变异是真正有活性的。所以我们说肺癌是体现NGS价值的最佳瘤种。

目前, 传统的检测方法面临四个方面的挑战：（1）许多传统的检测方法（如FISH）依赖于人工判读, 人工判读必然存在人与人之间、科室之间、医院之间判读时的主观性和个体差异。（2）越来越多的靶向药摆在了医生和患者面前, 越来越多的检测变成了必须, 而临床微量标本很难满足多项检测的需求。（3）肿瘤具有高度异质性, 存在如何了解肿瘤突变全景的需求。（4）肿瘤不是静态的, 是动态进化的, 我们希望能真正实现对病程的动态监控。NGS可以解决传统检测方法面临的四个方面的挑战：（1）NGS提供的数字化标准化平台, 可以满足不同人员、不同批次之间的高重复性; （2）一次检测可以完成多个基因突变融合扩增的平行检测, 满足所有分子检测需求; （3）对超低丰度突变的高灵敏度检测, 可以还原肿瘤中多个亚克隆的全景, 尤其是对全身的不同病灶进行检测时, 肿瘤的进化树可以非常清楚地呈现在我们面前; （4）当我们把灵敏度调到血液标本可以稳定检测到突变时, 液体活检对于中晚期患者可以作为组织活检的有力补充, 实现动态监控。

所以在NCCN、ASCO、ESMO的指南中都对NGS的应用作了推荐。

2015年NCCN非小细胞肺癌指南述：EGFR和ALK检测可以并入多重/二代（NGS）测序分子检测。NCCN强烈推荐比现有方法更高通量的分子检测, 筛查商品化靶向药的靶点突变, 或适当建议患者参加临床试验。

2014年ASCO指南指出：将会根据临床经验, 把更多的分子靶标列入检测范围。在标本有限的前提下, 现有方法对每个分子单独检测将会非常困难。而新的检测方法（如NGS）可以进行多位点同时检测, 在临床中对比传统方法有很大的优势。

2014年ESMO指南强烈推荐：多通道平行检测, 例如NGS技术（特指Panel检测组合）, 可同时分析多个可能的靶向药靶点变异, 是一种节约成本和标本的检测方法。已有充分质控表明, 这是一种适合临床使用的突变检测方法。

记者：NGS作为一项新型检测技术, 通过完整的检测流程即可达到预期目标, 这项技术在向临床实践推进时, 是否还存在一些技术或操作上的难点?

揣少坤博士：NGS听上去是一个非常完美的技术, 通过少量的DNA即可捕获患者的遗传信息。我们期望的、理想的NGS检测过程是这样的：非常方便地取到人体内的匀质肿瘤组织, 轻松取出其中的一部分, 切成很多一模一样的小片, 从其中一片提取出大量的、新鲜的、完整的DNA, 没有杂质, 通过技术的方法从这些DNA均匀收集到全部我们感兴趣的基因片段, 通过NGS得到绝对准确的DNA信息, 轻松辨认出基因突变位点, 检出的所有突变都具有明确的临床意义或用药相关性, 这个过程中患者可以耐心等待检测结果, 给实验和分析充分的时间。目标是：通过测序数据还原肿瘤真相, 提供精准治疗依据。

而真正的临床现实情况是, 在取材、建库、测序和分析解读四个步骤都与理想状态存在很大差异。取材时, 我们取到的标本可能是混有坏死组织的高度异质性的肿瘤, 不知道取到的组织能否代表原始的肿瘤, 也不知道取到的组织是否含有非肿瘤细胞; 在标本处理和保存过程中, DNA经常出现降解和损伤; 基因片段富集过程无法绝对均匀和干净; 测序过程中, 即使最高质量的测序仪也无法达到100%的准确率, 完全不进行真假阳性的判读将在每例标本中发现成千上万个“ 基因突变” ; 解读过程中影响因素更多, 受到不断推出的新药、不断开展的新临床试验、人种之间的差异、互相矛盾的临床证据、数以万计的参考文献等诸多因素的影响; 患者每天都在非常焦急地等待检测报告, 检测可谓是与时间在赛跑。可见理想和现实间存在着很大的差距。

为了缩小理想与现实之间的差距, 我们做了很多的努力, NGS流程中最重要的几个技术要点是：（1）均匀地富集感兴趣的DNA, 选择最佳建库方法。（2）在DNA层面检测多种变异形式。强调多种变异形式准确的定性、定量检测, 现有数据说明, NGS可以提供更精确的肿瘤突变全景并显著增加“ actionable” 靶向突变检出率。（3）精细的标本前处理与质控, 强调标本的质量。（4）标准化自动标本管理。（5）选择合适肿瘤领域的测序平台。（6）精确计算测序深度。（7）专注于临床意义的Panel设计。（8）定制化自动分析系统, 一个应用于临床NGS检测的分析系统需要兼顾自动化与定制化。（9）突变临床意义的解读数据。目前存在大量过度解读的情况, 我们认为解读的“ 假阳性” 与检测的假阳性同样背离精准医疗的方向, 都会对患者造成伤害。

我们希望的是, 在检测过程中能对所有有临床意义、科学进展有兴趣的位点进行分子检测, 患者能得到基于确凿临床证据的、谨慎的“ 精准治疗” , 急需行业共识与标准化的完成。需要讨论的话题还很多, 包括：适用于不同标本与检测目的的技术平台与检测参数? 检测基因与区域的选择? 标本与数据的质控标准? 假阳性与假阴性的平衡与取舍? Bioinformatics best practice? 临床意义证据等级的界定?

目前, 基于NGS的液体活检已经呈现出非常明显的平台优势。 如疾病进展的血液标本回溯性NGS检测的结果与基线组织突变状态完全吻合, 且突变丰度与疾病进程密切相关; 多中心液体活检组织血液比对实验中, 晚期患者敏感性> 85%, 特异性> 98%; 多例无法取到活检组织的患者, 通过ctDNA标本检出的ALK、EGFR等靶向药物的新型耐药机制。最终我们希望通过液体活检的动态监控可以呈现患者癌症进化的完美曲线, 我们还有很多工作要做, 但我们坚信, 液体活检作为组织活检的补充并且应用于肿瘤的动态监控必将成为理想的结点。

记者：陆教授, 您是肺部肿瘤学专家, 请您从临床层面介绍一下NGS的发展情况、优势以及在肺癌研究领域的应用情况。

陆舜教授（上海交通大学附属胸科医院、上海肺部肿瘤临床研究中心）：从上世纪80年代开始, 有学者进行了有关基因与癌症的研究。1986年Renato首先在《Science》上发表了有关文章, NGS在肿瘤研究中经过了30多年的探索, 早年的研究仅限于科学研究和药物研究, 2008年有学者报道应用NGS发现了一些位点、然后进行了针对位点的治疗。

应用NGS技术进行肿瘤分子水平诊断开始于2000年, 美国COSMIC、TCGA等的数据显示, 2000-2010年期间NGS在肿瘤领域做了探索性的研究, 应用NGS技术发现肺癌的驱动基因是在2008年。目前在临床领域已广泛开展单个生物标志物和多个突变位点的检测, 已开始高通量技术和NGS技术的探索。2013年11月FDA已批准Illumina的MiSeqDx测序仪（NGS）用于肺的囊性纤维化的筛查和诊断, 高通量测序技术已经开始进入临床应用。其间随着检测技术的不断进步检测成本逐渐下降, 技术的发展和价格的改变（2014年）预示着全基因组学时代的真正到来, NGS技术包括但不局限于以下四方面：全基因组测序、全外显子测序、全转录组测序和靶向靶标测序。

NGS包括大量基于不同技术的方法, 采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术, 阵列上的DNA标本可以被同时并行分析, 与传统的检测方法比具有很大的优势：（1）准确性高, 准确率高达99.99%; （2）快速, 比传统的Sanger测序法快100倍; （3）成本低, 每个碱基的测序成本是Sanger测序法的几十分之一; （4）方法简便高效; （5）能同时检测不同形式的基因变化。

NGS技术在肺癌研究领域的应用主要在三方面：发现驱动基因、临床试验设计、耐药机制研究。

首先是通过NGS技术发现少见驱动基因。随着NGS技术在临床研究中的开展, 2012年的4项重要研究（分别发表在Nature Genetics、PNAS、Nature和Genome Research）开启了运用NGS发现肺癌驱动基因的热潮, 通过一些病例的研究发现了一些重要的罕见基因。韩国学者在一位33岁不吸烟的男性晚期肺癌且EGFR、ALK和K-RAS均阴性的患者肿瘤组织中, 首次应用NGS技术发现了KIF5B-RET基因融合, 应用同样的检测方法, 获得了KIF5B-RET基因融合的人群流行病学数据, KIF5B-RET基因融合在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的融合率为1.4%、在肺腺癌的融合率为1.7%, 进一步的分析认为KIF5B-RET基因融合是NSCLC尤其肺腺癌的一个独特的分子亚型, 随后开展了大量的临床试验, 初步的研究结果显示卡博替尼治疗RET融合的肺腺癌有效。美国和韩国学者分别在晚期肺腺癌患者组织中发现了ROS1基因融合, 然后在1 073例患者中发现了18例（1.7%）ROS1基因融合的患者, 通过功能鉴定和临床研究认为ROS1基因融合是肺腺癌的一个独特分子亚型并可从克唑替尼的治疗中获益。同样韩国和美国学者发现了MET基因14外显子跳跃突变, 体外试验显示克唑替尼能够有效抑制含MET基因14外显子跳跃突变细胞系的增殖; 1例74岁肺肉瘤术后多发转移患者应用NGS技术检测肿瘤组织发现MET基因14外显子跳跃突变, 应用克唑替尼治疗2个月后明显缓解。2013年美国科罗拉多大学报道, 在肺腺癌组织中发现NTRK1融合基因。2015年美国麻省总医院报道了1例NTRK1融合的肺腺癌伴多发脑转移患者五线应用Entrectinib治疗, 肺部和脑部病灶均获得部分缓解, 缓解时间超过6个月, 初步显示Entrectinib治疗NTRK1融合肺腺癌有效。应用NGS技术在肺腺癌、肺鳞癌的不同亚型中少见驱动基因的研究仍在进行中。

第二方面是对临床试验设计的影响。肿瘤基因组学指导的临床试验设计根据分子特征将患者进行分类, 大家知道的篮子试验和雨伞试验已经成为新型的临床试验模式。雨伞试验是针对单一瘤种（肺癌）应用NGS技术发现不同位点, 进行不同位点的治疗研究; 篮子试验是在不同瘤种中进行某种基因的研究。在过去的5年中, 在欧美国家的很多大的研究机构都在开展这种基于某种生物标志物设计的临床研究, 约有20多项基因组学指导的临床试验正在进行中, 如美国的 NCI-MATCH研究。

第三方面是对耐药机制研究的影响。通过NGS技术, 可以敏感地检测到大量上调或下调的耐药基因, 为未来耐药机制和新药的研究提供了理论基础。从EGFR突变NSCLC患者检测到厄洛替尼敏感性和耐药性肿瘤的FFPE活检标本。2015年ASCO报道的肺癌的两种驱动突变（同时也是EGFR-TKI的耐药机制）MET基因14外显子缺失和NF1基因失活突变都是通过高通量NGS测序检测出来的。

记者：您认为NGS将如何与肺癌临床实践结合?

陆舜教授：肺癌精准医学要求精准诊断和靶向治疗相结合, 是我们目前的重要目标。我们的研究已经发现在亚洲人群中肺腺癌患者的基因突变率比较高。信号通路的复杂性和基因突变类型的多样性决定了传统的检测技术采用的一个或几个基因检测已经不能满足我们的要求, 并且多次检测价格昂贵（过万元）、样本量大、时间长、无法分析上下游通路, 单位点检测可能会漏掉大量信息, 而NGS则一次可检测几乎所有突变类型, 发现驱动基因之间的相互关系和上下游通路。我们希望通过NGS技术显著提高突变基因和耐药基因的检测率, 从而指导靶向治疗的决策。2016年NCCN指南已经推荐NGS用于晚期NSCLC患者的分子分型。

总之, 随着研究的深入, 我们需要用高通量技术, 更快速、更简捷地不断发现新的肺癌驱动基因, 不断完善肺癌的驱动基因谱, 并研发新的靶向治疗药物。EGFR基因是目前突变频率最高、最多患者治疗获益的靶点, 但治疗后的耐药仍需要通过精准的检测方法发现可能的耐药机制, 开展罕见耐药基因新的药物研发。由于原发或继发耐药的发生, 未来驱动基因的检测决不是一次性就可解决的问题, 需要伴随治疗过程进行动态检测。测序技术的不断发展优化是未来根据基因选择靶点治疗的技术保证, 是个体化治疗的基础。

记者：刘教授, 我们已经知道, NGS已在推动肺癌精准医疗中广泛应用, 您认为目前NGS的应用还存在哪些问题?

刘晓晴教授（中国人民解放军307医院）： 2015年Kenneth等首先在 《Nature Medicine》报道, 7例T790M突变原发耐药的肺癌患者, 应用NGS技术发现了耐药基因C797突变, 随后在更多的病例中得到验证, 2015年世界肺癌大会上有学者报道, AURA试验中, 对AZD9291获得性耐药的T790M突变阳性的患者, 采用三种互补方法（血浆游离DNA基因分型法、20个基因扩增子建库和全基因组NGS、活检标本的分子生物学分析）进行研究, 发现了HER2基因扩增、MET扩增、BRAF V600E以及C797S突变。实际上少见基因和耐药基因的发现离不开NGS技术。一群病理诊断为原发肺腺癌的患者, 通过分子检测可将他们分为不同基因突变的人群, 经治疗后, 会发现同一种基因突变的患者可检测出不同的继发耐药基因, 给予针对耐药基因的治疗后能进一步发现更多的基因改变。在这个过程中, 这些基因的发现应用常规的检测是无法实现的。

我们认为目前NGS在基因检测方面具有很大的优势。各种类型的基因检测技术都有其各自的特点。传统的Sanger测序法在成本和操作方面有优势, 但是灵敏度较低; ARMS法灵敏度、准确度和操作方面都存在不小的优点, 但是通量较低; BEAMing、数字PCR和TAM-seq技术灵敏度最高, 特异性也很好。而NGS的灵敏度高、通量大、标本要求量少、突变类型的检测也很全面, 几乎能检测任何类型的突变方式。此外, NGS能够对未知的突变进行一次性检测, 这是其他类型的技术无法实现的, 这个优点使得NGS在未知突变检测、耐药机制分析等方面存在很大的优势。当然, 当前NGS的检测成本相对较高, 相信随着技术的发展, NGS的成本会呈现逐渐下降的趋势。

目前NGS在肿瘤临床和研究中的应用已很广泛。可包括以下几个方面：（1）预防, NGS可使肿瘤预防措施前移。进行肿瘤易感基因检测, 预知肿瘤发生风险, 提早采取措施或增加体检次数以预防肿瘤的发生。（2）诊断, NGS能对血浆中的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）进行高灵敏度、高特异性检测, 多基因同时检测大大提高了肿瘤早期诊断的灵敏性和特异性。（3）治疗, 利用NGS对基因进行一次性高通量全面的检测, 发现驱动基因突变, 从而进行个性化靶向用药指导。（4）预测疗效和预后, NGS对ctDNA进行术后或治疗后动态监测肿瘤发生发展, 预测复发转移、疗效和药效评估。能够及早发现耐药机制, 从而及时指导用药方案跟进。（5）研究和药物开发, NGS具有全面检测的特点, 能够发现一些未知的潜在重要突变, 对肿瘤发生发展和耐药机制等研究有重大应用潜力和价值。同时探寻一些新的药物靶点, 推动药物的研发。

目前NGS的应用存在的问题主要在以下几方面。

首先, 由于目前从事基因检测的公司很多, 各公司的综合实力、应对新技术挑战的能力不同, 没有行业标准、技术标准规范。如何对NGS技术进行标准化?需要制定癌症患者NGS技术使用指南, 期待中国肿瘤驱动基因分析联盟（CAGC）的NGS技术共识。

第二, 目前在世界范围内, 有20多个基因组学指导的临床试验正在开展, 如何解读和理解这些基于特殊基因或特殊药物、特殊检测技术而设计的临床研究结果?研究结果是否可以指导常规临床实践?

第三, 技术挑战问题。面对目前临床常规成熟且推荐的检测技术, NGS技术的定位（互补/替代, 常规实践/研究探索）?NGS从技术层面仍有短处和不足, 面临第三代和第四代测序技术的挑战和优势, NGS如何发展、保持和发挥?

第四, NGS为肿瘤基因组学的研究提供了大量的数据, 在全球性的48个肿瘤基因组研究项目中, 已经发现了459个与肿瘤相关的驱动基因, 但是目前有对应的靶向药物（包括已经获批以及临床在研）的驱动基因不到四分之一。大多数的基因功能, 尤其是在肿瘤的发生及发展过程中的功能都还没有研究清楚, 更谈不上应用于精准医疗, 对这些未知领域的深入研究将是未来一段时间内肿瘤基因组以及转化医学的主要任务。在目前可获得靶向药物有限的情况下, 势必将我们陷入巧妇难为无米之炊的境地, 这也背离了我们开展多基因检测指导临床实践的初衷。

第五, 目前, 利用NGS技术可以检测到越来越多的基因, 在临床工作中如果出现多个异常基因时, 如何合理安排药物治疗?检测到两个或三个基因突变时, 是否两个、三个甚至多个药物联合?基因的检测丰度不同时我们如何治疗?联合用药时药物疗效、毒性及药效经济学如何评价?NGS的检测结果和常规检测方法的检测结果不相符时, 哪种技术更符合临床实际本质?

第六, 2016年NCCN肺癌指南对基因突变检测的推荐是可进行7个驱动基因的常规检测, 如果NGS向临床应用转化, 目前肺癌临床对NGS的要求只是包含NCCN推荐的7个靶点还是更多?在疾病发展的不同时期NGS检测的范围和重要性? NGS服务的侧重点是临床还是科研?区别在哪里?

对于肺癌精准治疗而言, 存在的问题很多, 需要临床医生和检测公司精诚合作、共同努力, 中国临床肿瘤学会去年成立了中国肿瘤驱动基因分析联盟（CAGC）, 将聚集NGS技术应用于精准医疗的中国力量, 我们期待NGS能推动肺癌精准医疗进入新的高度, 真正落实到临床。

记者：何博士, 我们已经知道液体活检, 包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）和ctDNA已用于临床研究, 请您给我们介绍一下CTC和ctDNA在肺癌的应用情况。

何伟博士（格诺思博生物科技南通有限公司）：大家都知道, 肿瘤在治疗过程中会复发、治疗后会耐药。从生物进化的角度来看, 肿瘤是一个极其聪明、变化多端的物种, 在肿瘤本身的发生发展及后续治疗药物的干预下, 肿瘤的遗传学背景可能一直处于动态变化的过程中。因此, 仅根据初诊时穿刺标本所反映的肿瘤分子特征来指导肿瘤的后续治疗可能会产生偏歧。临床专家认为多次肿瘤活检对指导临床治疗是非常重要的, 但多次活检对临床工作来说存在很大的困难, 临床急需一种非侵入性的方法能便捷、实时地反应病情, 指导临床治疗。非侵入性的方法可取到的、常用的标本包括血液、胸水、腹水、唾液、尿液、骨髓等, 其中血液中所含的信息量大且容易获得; 液体活检的检测对象包括CTC、ctDNA、microRNA和外泌囊泡小体（Exsome）, 目前研究的热点是CTC和ctDNA。

CTC和ctDNA在肺癌中的应用包括辅助诊断、复发监测、治疗方案选择和疗效评估、耐药机制和新药研发。

CTC是从原发肿瘤或转移灶脱落下来、释放到外周血循环系统中的肿瘤细胞。CTC在肿瘤中的应用最早见于乳腺癌, 有学者研究关注晚期乳腺癌患者CTC的数量与预后的关系, > 5 CTC/7.5 mL患者的无进展生存期（2.7个月）和总生存期（10.1个月）较≤ 5 CTC/7.5 mL患者的无进展生存期（7.0个月）和总生存期（18.0个月）差, 即预后差。近年来有关CTC在肺癌领域的应用也有一些研究报道。研究结果提示, CTC可用于Ⅰ ~Ⅳ 期NSCLC的检测, 与肿瘤标志物联用可使敏感度提高7.8%, 特异度提高4.6%; CTC对Ⅰ 期肺癌的阳性检出率高达67.2%, 而其他最优的肿瘤标志物的敏感度仅为32.3%; CTC数目与化疗过程中的肿瘤大小呈正相关, 且比肿瘤变化更快, 可用于化疗疗效评估; Ⅳ 期NSCLC患者化疗后CTC下降组的无进展生存期比上升组长（251天vs. 155天）; CTC检测辅助CT扫描可以将小结节的判别假阳性率降低到< 10%, CTC检测联合CT扫描可以大大提高小结节诊断的特异性。一项小规模尚未发表的临床数据显示, 将Ⅳ 期肺癌患者按CTC数量分为CTC≥ 16和8.7< CTC< 16两个亚组, 一线培美曲塞化疗后, CTC≥ 16亚组的中位无进展生存期为14.9个月, 总有效率为75%, 疾病控制率为100%, 而8.7< CTC< 16亚组的中位无进展生存期为3.1个月, 总有效率为11.1%, 初步认为CTC分型亚群可以提示培美曲塞一线化疗的最佳受益人群。我们认为CTC可较好地应用于肺癌的辅助诊断、疗效评估和复发监测。现在人们对CTC的研究已不仅仅是计数, 更希望通过利用CTC的分子特征去窥测原发肿瘤, 探寻肿瘤转移的机制并建立CTC细胞库进行药敏试验。当然CTC是否可以精准评价免疫治疗、T细胞等免疫细胞的特征是否可为免疫治疗提供好的指导、杀伤CTC或阻断CTC归巢是否为有效的治疗干预方式之一有待进一步研究。

ctDNA是肿瘤原发灶可转移灶的肿瘤细胞脱落下来、释放到外周血循环系统中的DNA片段, 片段长度通常160~180 bp。一些已经发表（ASSESS）和正在开展（CTONG1405）的研究数据显示, ctDNA应用于EGFR检测, 组织/细胞标本和血浆标本的突变一致率不高, 约58%, 总体情况看, 活检标本中肿瘤细胞含量少且不均匀, 存在质量挑战问题。一项尚未发表的小型研究数据显示, 67例Ⅰ ~Ⅲ 期EGFR突变阳性NSCLC手术完全切除患者病理切缘阴性, 通过ARMS Plus-PCR法能检测出34%的切缘阳性率, 说明存在病理看不出来的微扩散, 精确的检测可筛查出真正术后 EGFR突变阳性、可从TKI治疗（相对化疗）获益的患者。一项ctDNA用于厄洛替尼一线治疗的EGFR突变晚期NSCLC患者的耐药监测显示, 9例患者T790M突变均伴随敏感突变产生, 且浓度低于敏感突变。新近发表在《Cell》上的研究也提示, 通过ctDNA检测可以发现一些组织来源的信息。

总之, CTC和ctDNA已应用于肺癌的治疗研究, CTC在肺癌的辅助诊断、复发监测、对晚期患者的化疗方案选择和疗效评估方面的应用已有确切的数据, ctDNA在肺癌患者靶向药物的选择、耐药机制和新药研发方面有绝对优势。

记者：王教授, 您在液体活检和基因检测方面做了大量的研究工作, 请您给我们介绍一下液体活检的临床应用现状和前景。

王洁教授（中国医学科学院肿瘤医院）：临床医学和基础医学的紧密结合加快了精准医学的进程, 催生了一些新的临床治疗和研究模式, 临床医生能在更深刻地触摸到肿瘤的“ 脉动” 的基础上决策治疗方案。分子诊断技术的变革使靶向治疗研究向纵深方向发展, 肿瘤的时间和空间异质性提示实时监测不同的耐药机制对指导后续治疗的重要性。目前我们临床医生最需要的是通过重复活检实现耐药的动态监测、克服肿瘤组织的异质性、需要建立实时定量动态的多基因平行检测体系, 指导临床治疗方案的调整, 而这些仅靠组织标本是无法实现的, 液体活检为我们提供了无限的可能性。

临床上液体活检最常用的检测项目是ctDNA和CTC。

目前利用ctDNA在肺癌分子靶点检测、动态监测及耐药机制探寻上的应用, 总体而言, 研究结果是鼓舞人心的。不同中心、不同规模、不同方法的研究数据告诉我们, 以组织标本为金标准, 血浆EGFR突变检测的特异性可达90%, 敏感性60%~80%, 一致性超过80%, 血液中ctDNA的定量检测更能体现血液标本检测的优势。与组织检测相比, 血浆ctDNA耐药基因检测的一致性尚可, 可作为组织学检测的补充。在AZD9291临床试验中, 对38例患者的血浆ctDNA用4种不同的检测方法进行EGFR突变检测, 与组织检测相比, 具有高度的一致性。其中MoIMD droplet dPCR的数据较理想, 一致性为74%, 敏感度为71%, 特异度为83%, 我们认为尚没有达到临床的要求。液体活检对靶向治疗的预测性好, 近年的报道告诉我们, cobas EGFR_blood 检测能可靠地用于检测血浆EGFR突变, 在FAST ACT 2研究中, 血浆EGFR突变数据是生存结果的有力预测因素, 已有血浆ctDNA用于第三代药物治疗疗效预测的报道。液体活检的最大优势是能动态监测, 能提供治疗过程中不断改变的信息。FAST ACT 2研究的结论告诉我们, 对于EGFR突变并且接受一线EGFR-TKI治疗的患者而言, EGFR突变状态可能是疗效预测因子。越来越多的数据告诉我们, 在肿瘤的治疗过程中, 敏感突变和耐药突变都在变化, 需要动态监测。总体上看, 液体活检的优势主要集中在三方面：对EGFR敏感性检测的一致性高, 可作为组织学检测的补充; 对耐药基因检测的一致性尚可, 可作为组织学检测的补充; 对靶向治疗的预测性好, 可以实现动态监测。

关于CTC的研究, 就目前的检测技术而言, 还存在一些问题。首先是CTC的数目少; 第二是CTC漏抓, 肿瘤细胞表型转变导致抗体依赖性, 使部分CTC漏捕; 第三是CTC异质性, 每个肿瘤细胞代表的遗传学背景不同。在未来的研究中, 如何克服这些问题是我们临床医生和生物检验技术面临的共同挑战。

已有的多项单中心、多中心研究及Meta分析数据均显示, ctDNA EGFR突变检测敏感性为60%~70%, 特异性为92%~100%, 并具有较高的临床疗效预测准确性。我们认为液体活检在临床的应用前景非常广泛, 可以大胆地设想其五大应用前景：第一, 未来可以液体活检先行（初筛）, 组织活检作为补充; 而现阶段应该加强组织标本、ctDNA和CTC三种标本的互补。第二, 探寻分子耐药到临床耐药的最佳界值, 实现对耐药的应对从治疗到预防的转变。通过绘制靶向治疗过程中耐药“ 进化” 树, 建立外周血动态、定量、多基因的检测体系, 实现对耐药的实时监测和预防性治疗。 第三, 以外周血驱动基因定量检测为基础探索不同的治疗策略。第四, ctDNA深度分析有助于发现新的耐药基因。第五, 基于单细胞的全基因组、外显子组、转录组的分析将有助于更深入地洞察肺癌的耐药和转移机制并实现对其监测。

总之, 随着更多驱动基因的确定, 肺癌的靶向治疗研究向纵深方向发展。实时动态的多基因检测平台的建立具有举足轻重的作用。目前组织学检测仍然是金标准, 但存在诸多局限性。液体活检将成为未来的发展方向。液体活检正经历从单基因到多基因、从定性到定量、从静态到动态、从有创到无创的变革。

记者：周教授, 对于晚期初诊肺癌患者, 组织标本活检和液体活检该如何抉择?

周彩存教授（同济大学附属上海市肺科医院）：首先我们应该明确液体活检和组织标本活检各自的优势和不足。组织标本活检的优势：肿瘤细胞含量高、直接来自肿瘤局部信息、方法学要求较低、临床应用基础好。组织标本活检的不足：组织获取困难、重复活检更困难、组织的有限性、肿瘤的异质性。液体活检的优势：无创、标本易得、重复获取容易、可动态检测、可克服异质性。液体活检的不足：敏感性较低（60%~70%）、方法学要求高、解读注释难度较大、价格偏高。

对于晚期初诊肺癌患者我们需要知道以下四方面的信息：临床分期、病理分型、PS评分和肿瘤的分子信息。肿瘤的分子信息需要依据组织、体液的检测, 其可得性非常重要。精准医学时代的肿瘤诊断和治疗需要在检测方面实现三个目标：获得肿瘤的分子分型、动态获取即时信息并尽量获取肿瘤的全部信息。晚期肺癌患者的组织活检的确存在一些问题, 因为组织获取困难（23%~30%的患者无法获得标本）, 重复活检更困难, 一些术后患者的肺部已没有肿瘤组织, 而转移部位的组织又无法获取, 肿瘤标本存在异质性。因此需要液体活检来指导临床治疗。液体活检不仅有助于辅助诊断、监测复发, 对于晚期患者个体化治疗方案的选择和疗效评估非常有意义, 而且可以预测耐药机理、有助于研发新药。随着技术发展, 液态活检的作用越来越大, 越来越受到重视, 但是对于诊断而言, 组织标本的获取仍然非常重要, 现阶段肺癌的诊断一定要取得组织标本, 液体活检只能作为组织标本活检的补充。

记者：朱博士, 请您给我们介绍一下近年来常用的液体活检技术及它们优势和不足。

朱冠山博士（厦门艾德生物医药科技有限公司）：肿瘤组织标本的突变检测方法很多, 当下大家共识认为ARMS技术是组织标本突变检测最合适的技术。2015年《NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识》中明确表示, 液体活检是有价值的补充方法, 特别是动态监测; 液体活检流程中的三个环节（样本采集、cfDNA提出、突变检测）同等重要均须规范, 液体活检方法敏感度需继续提高。

目前常用的液体活检技术有ARMS、ddPCR、NGS、SuperARMS等。

ARMS技术, 优点为：简便快速, 特异性好, 技术普及度高, 适合医院广泛开展, 已有法规支持临床应用。不足为：只能检测已知突变, 敏感度目前只有70%左右。是目前唯一一项法规支持临床应用的技术, 可作为组织检测的重要补充, 是否可考虑作为临床快速初检值得探讨。

ddPCR技术, 优点为：敏感度相对高（80%）, 相对精确绝对定量。不足为：只能检测已知突变, 技术有待普及, 敏感度或有瓶颈。目前适用于转化性研究, 未来有望用于动态监测。

NGS技术, 优点为：可检测未知突变, 检测基因数量不受限制。 不足为：建库技术复杂, 普及和标准化有一定困难, 建库过程原始信息丢失严重或成为敏感度潜力发挥的限制因素。适用于多靶标检测的药物临床研究, 也适用于未知突变特别是新耐药机制探究。

SuperARMS技术, 优点为：简便快速, 敏感度高, 特异性好, 技术平台普及度高, 适合医院广泛开展。不足为：只能检测已知突变, 定量功能需进一步开发。目前可用于已知突变的转化性研究, 未来有望成为普及性的临床液体活检方法。

比较一下这些液体活检技术的优势和不足, 不难看出, 这四项技术都可用于研究。就临床应用而言, ARMS技术是目前唯一可应用的。

记者：王教授, 请您给我们介绍一下CTC和ctDNA在肺癌早期诊断和术后复发监测方面的研究进展和看法。

王群教授（复旦大学附属中山医院）：肺癌的早期诊断, 通常的方法是通过影像学发现肿块, 然后取得病理报告, 同时可借助血清学肿瘤标志物的检测作为辅助。但这些都存在局限性：影像学对< 5 mm的肿块无法诊断, < 10 mm的肿块无法判断良恶性; 病理学是我们临床的金标准, 但具有侵入性, 一些小肿瘤取材困难, 在整个疾病的诊治过程中不能做到实时监测; 现行的血清学检测方法的特异性和敏感性均不高, 在肺癌的价值不高。

以前我们一直认为CTC主要与晚期肿瘤关系密切, 转移灶由晚期肿瘤的脱落细胞进入血液循环, 然后种植下来形成转移灶。CTC能否用于肺癌的早期诊断呢?2008年Hü semann等做了HER2转基因乳腺癌小鼠模型, 发现种植肿瘤17~18周时, 外周循环血中可检出代表肿瘤的CK+/HER2+细胞, 此时肿瘤体积小于1 mm3。Rhim等2012年报道, 在小鼠的胰腺癌模型中发现CTC可在肿瘤形成之前进入血液, 并保持间叶细胞形态。说明种植的肿瘤形成以前就可以检测到CTC。这种现象可以帮助我们理解一些临床现象, 有些患者原发灶很小却已发生转移, 有些患者没有症状却发生了多处转移, 原发灶和转移灶可能是并行发展的, 肿瘤早期已有CTC进入血循环。但CTC用于肺癌的早期诊断并无明显优势, 检出率不高。2009年日本学者报道, 150例肺癌患者用Cellsearch system检测CTC, 检出125例肺癌, 25例为良性, CTC在肺癌的检出率为30.6%, 且大部分为已转移的患者, CTC用于鉴别肺癌和良性疾病的受试者工作特征曲线下面积为0.598 （95%可信区间0.488~0.708）, P=0.122, 低于CEA（受试者工作特征曲线下面积 0.598 , 95%可信区间0.654~0.840） , 说明CTC对肺部良恶性病变的鉴别无临床意义。Cellsearch system对肺癌CTC检出率低的原因是肺癌细胞表型转变（上皮间叶转化, EMT）导致抗体依赖型 （EpCam和角蛋白）捕获技术漏补部分CTC。2014年有学者采用膜过滤分离肿瘤细胞技术（ISET） 对168 例慢性阻塞性肺病患者和77 例健康志愿者进行筛查, 每年做一次CT 扫描和CTC检测, 发现了 5 例慢性阻塞性肺病 CTC阳性患者（CT 扫描均未显示肺部有任何肿瘤组织）, 这5例慢性阻塞性肺病患者在检出CTC的1~4 年后被检出早期肺癌, 手术标本亦证实是肺癌, 而未检出CTC 的163例慢性阻塞性肺病患者及77例对照人群在 5年内均未发生肺癌。这项研究告诉我们, CTC检测与CT扫描结合或许是肺癌筛查和早期诊断的有效手段。

CTC用于肺癌术后复发监测的研究较少。2007年日本学者报道9例术后CTC检测为阴性的肺癌患者, 中位随访期14个月后均未出现复发, 治疗后监测过程中CTC提高提示肿瘤复发。2016年西班牙学者也报道了CTC用于预测术后复发的研究数据。56例Ⅰ ~Ⅲ 期根治性切除的NSCLC患者, 检测术前、术后1个月CTC, 中位随访16个月。术前CTC检出率为51.8%, 术后1个月下降为32.1%; 术前平均CTC计数为 3.16, 术后1个月下降为0.66。生存分析提示术后CTC的存在和术后早期复发、无病生存期缩短显著相关, 多因素分析提示术后CTC是无病生存期的独立预后因子。这些研究告诉我们, CTC可用于预测术后早期复发的患者, 但还需要临床研究的进一步证实。

尽管多数肺癌患者ctDNA浓度小于0.5%, 但新技术的产生使ctDNA检测在早期肺癌的诊断成为可能。目前ctDNA的EGFR点突变检测方法主要有ARMS法、数字化PCR和NGS, 它们的敏感性、特异性和结果一致性均较高, 但多数都为单基因检测, 要做肺癌的早期诊断, 单基因检测是不够的, 因为肺癌的驱动基因非常复杂, 存在肿瘤的异质性, ctDNA的浓度低, 做多基因或全基因检测时, 很多低丰度基因容易被变异的生殖细胞干扰, 很难得到一个满意的结果。2014年有学者在《Nature Medicine》上报道的用CAPP-Seq技术（深度测序肿瘤个体化建档法）进行多基因检测的结果令人非常振奋。这项研究检测了139个基因的521个外显子和13个内含子, 总体敏感性为85%、特异性为96%, Ⅰ 期肺癌患者的敏感性为50%、特异性为96%, Ⅱ ~Ⅳ 期患者的敏感性为100%、 特异性为96%。在Ⅰ 期肺癌患者中ctDNA水平和肿瘤体积显著相关。

ctDNA用于术后复发监测, 同样面临挑战, 因为肺癌的基因很复杂, 转移灶和原发灶的基因可能不同, 低丰度基因可能被干扰, 肿瘤相关的异常基因表达可能随着术后药物治疗而发生改变（如化疗可使EGFR突变频率降低）, 因此如何选择合适的监测基因是一个要解决的难题, 另外, 根治性术后如果相关监测基因仍能检出, 后续怎样治疗也是有待解决的问题。

CTC和ctDNA在肺癌的早期诊断和复发监测都可以发挥作用, 两者的侧重点不同。CTC在早期诊断、疗效评估和复发监测方面价值更高, ctDNA在治疗选择和耐药检测方面更有价值。

高敏感技术的产生使得液体活检用于肺癌早期诊断和复发监测成为可能。但还有很多问题需要解决：（1）液体活检作为通用的癌症筛查手段可行吗?提高检测方法敏感性的同时, 假阳性率也会增高; 还未发现所有肿瘤都通用的标志物; 不是所有肿瘤都会以相同的方式释放ctDNA; ctDNA浓度不仅仅与肿瘤负荷相关, 也与释放至血液的阻力相关（如血脑屏障）。（2）可能会带来过度治疗的问题。对无症状、未经选择的人群进行筛查价值存疑; 过度治疗会严重影响患者的生活质量; 检测结果可能会对患者的心理造成不良影响; 会造成医疗资源的浪费。（3）过分关注液体活检可能会忽视其他生物标志物和肿瘤生物网络, 如免疫印迹、蛋白组学、激酶组学、微生物组学及肿瘤微环境。 因此液体活检（CTC和ctDNA）目前在肺癌领域仅限于科研探索, 亟待大规模的临床研究验证。

记者：杨教授, 请您谈谈您对液体活检用于肺癌筛查和术后监测的看法。

杨帆教授（北京大学人民医院）：用于液体活检的检测指标包括CTC、ctDNA、ctRNA、外泌体、miRNA, 用得比较多的是CTC和ctDNA。尽管从技术层面上讲, 早期NSCLC患者血中能检出CTC和ctDNA, 但将检测结果应用于早筛查和术后复查会面临一些问题和挑战。

就筛查而言, 肺癌的高发人群是重度吸烟者, 而这部分人正是无法检测到特异性基因者, 能查到ctDNA的患者多是非吸烟者, 即携带特异异常基因的患者和肺癌高危人群不重合, 存在成本效益问题。目前肺癌CTC没有有效的检测手段。在肺癌的定性方面, 有文献报道, 肺癌驱动基因突变是极早期事件, 可以潜伏多年; 驱动突变的转基因小鼠不一定发生肺癌（可以是肺腺瘤）。目前还没有一种异常基因只出现于肺癌。因此, 对于定性检测基因异常阳性者, 而影像学阴性时, 我们不能下诊断。液体活检用于肺癌筛查需要与影像学结合, 还有很多问题有待证实。

液体活检用于术后监测同样也存在问题。复发的肺癌, 存在原发灶与复发灶异质性的问题, 没有影像学证据, 检测结果对临床分期、复发部位、治疗决策没有帮助。

在孙燕院士、廖美琳教授、管忠震教授、吴一龙教授和王长利教授的主持下, 在与会专家的共同参与下, 本次论坛达成以下共识：

（1）精准医学是一项系统工程。（2）液体活检包括血液循环肿瘤细胞、血浆游离DNA和外泌体。（3）检测已知的、单个临床可药物抑制的靶点, 液体活检技术推荐ARMS方法; 检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点, 液体活检技术推荐NGS方法。（4）用于发现未知基因, 探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等, 液体活检技术建议使用NGS。（5）CTC和ctDNA可能用于肺癌早期诊断和复发监测, 但目前仅限于科研探索。（6）NGS用于临床研究, 需平衡患者利益、伦理要求和科学发现之间的关系, 以患者利益为至上。