引用本文
郭伟浜, 张绪超, 江本元, 黎扬斯, 田红霞, 苏健, 陈志红, 陈剑光, 严红虹, 吴一龙. 一种提高脑膜转移癌诊断率的新技术.循证医学, 2016,16(6): 375-378
GUO Wei-bang, ZHANG Xu-chao, JIANG Ben-yuan, LI Yang-si, TIAN Hong-xia, SU Jian, CHEN Zhi-hong, CHEN Jian-guang, YAN Hong-hong, WU Yi-long. A Noval Technology of Improving the Diagnostic Rate in Leptomeningeal Metastasis. Journal of Evidence-based Medicine, 2016,16(6): 375-378  
Doi:10.12019/j.issn.1671-5144.2016.06.017
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一种提高脑膜转移癌诊断率的新技术
郭伟浜, 张绪超, 江本元, 黎扬斯, 田红霞, 苏健, 陈志红, 陈剑光, 严红虹, 吴一龙
广东省人民医院肿瘤中心、广东省医学科学院、广东省肺癌研究所, 广州510080
通讯作者：吴一龙,Tel：020-83827812; E-mail:syylwu@live.cn

作者简介:郭伟浜（1984-）,男,广东汕头人,医学学士,从事肺癌分子生物学研究。

基金:广州市科技计划科学研究专项资助项目（201607010391）; 广东省科技计划公益研究与能力建设专项资助项目（2014A020212225）; 广东省科技厅重点实验室建设资助项目（2012A061400006）; 国家卫计委公益性行业科研专项资助项目（201402031）
摘要

目的 使用CellSearch系统和循环肿瘤细胞检测试剂盒（上皮来源）检测并计数疑似肺癌脑膜转移患者脑脊液中的恶性肿瘤细胞,探讨该技术检测脑脊液中恶性肿瘤细胞的可行性。方法 研究对象为20例症状明显的疑似肺癌脑膜转移患者和1例无脑膜转移的肺癌患者。每例患者收集首次经腰椎穿刺脑脊液10~15 mL,其中5~7.5 mL应用CellSearch系统检测脑脊液中的恶性肿瘤细胞数量,5~7.5 mL进行脑脊液液基细胞学检查,2 mL进行脑脊液生物化学检查。结果 使用CellSearch系统检测20例疑似肺癌脑膜患者的脑脊液,全部（100%）找到恶性肿瘤细胞;脑脊液液基细胞学法有12例（60%）找到肿瘤细胞。1例阴性对照未找到恶性肿瘤细胞。CellSearch方法与脑脊液液基细胞学比较差异有统计学意义（P=0.008）。结论 CellSearch技术用于检测脑膜转移癌患者脑脊液里的恶性肿瘤细胞对比传统技术更有优势,可作为一种新的可靠的辅助诊断脑膜转移癌方法。

关键词: 非小细胞肺癌; 脑膜转移癌; 脑脊液; 恶性肿瘤细胞; CellSearch技术
中图分类号:R734.2;R446.14 文献标识码:A 收稿日期:2016-11-19
A Noval Technology of Improving the Diagnostic Rate in Leptomeningeal Metastasis
GUO Wei-bang, ZHANG Xu-chao, JIANG Ben-yuan, LI Yang-si, TIAN Hong-xia, SU Jian, CHEN Zhi-hong, CHEN Jian-guang, YAN Hong-hong, WU Yi-long
Cancer Center, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences,Guangdong Lung Cancer Institute, Guangzhou 510080, China
Abstract

Objectives To evaluate the feasibility of using CellSearch and Circulating Tumor Cell Kit（Epithelial）to detect and count the malignant tumor cells in cerebrospinal fluid （CSF） from the lung cancer patients with leptomeningeal metastasis （LM）.Methods Twenty patients with obvious clinical symptom due to LM of lung cancer and 1 patient without LM were enrolled in this study. A total of 10~15 mL of CSF were colleted with the first-time lumbar puncture. 5~7.5 mL of CSF were used to detect the number of malignant tumor cells by CellSearch method. 5~7.5 mL of CSF were used to find the tumor cells by conventional cytology. 2 mL of CSF were used for CSF routine biochemistry analysis.ResultsMalignant tumor cells in the CSF were found in all 20 patients with suspected lung cancer LM by CellSearch technology. The tumor cells were found in 12 patients （60%） by CSF cytology method. Malignant tumor cell was either negative in the patient as negative control. Comparison of CellSearch technology and conventional cytology technology was statistically significant（P=0.008）.Conclusion The CellSearch technology seemed superior to conventional technology in terms of finding malignant tumor cells in CSF from the patients with suspected leptomeningeal metastasis, which might be a new reliable technology for the diagnosis of leptomeningeal metastasis in NSCLC.

Key words: non-small cell lung cancer; leptomeningeal metastasis; cerebrospinal fluid; malignant tumor cells; CellSearch techonology

脑膜转移癌（leptomeningeal metastasis, LM）是指原发灶中的肿瘤细胞在脑膜和脊髓蛛网膜下隙弥漫性散播和局灶性浸润的中枢神经系统转移癌, 常继发于白血病、淋巴瘤、肺癌和乳腺癌。LM是癌症患者致命的并发症, 其首发的临床表现为异常的神经系统症状。诊断LM有一定难度, 特别是在早期阶段。LM的诊断主要根据患者的临床特征、脑脊液（cerebral spinal fluid, CSF）的细胞学检查和/或影像学MRI检查。CSF细胞学检查找到肿瘤细胞是目前确诊LM的金标准, 但是该方法第一次腰穿检测肿瘤细胞的检出率只有50%~70%, 很多患者需要第二次、第三次腰穿才能找到肿瘤细胞, 三次腰穿的检出率大约是90%[1, 2, 3]。

CellSearch循环上皮细胞检测试剂盒是用免疫磁颗粒细胞捕获结合荧光染色方法, 用于全血中的上皮源性（CD45-、EpCAM+、以及细胞角蛋白8、18+及或19+）的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的计数检测。CellSearch检测CTC方法灵敏性高, 其能在7.5 mL抗凝血里检测到1个CTC; 该方法客观性强, 其通过结合到细胞膜表面和细胞核的荧光信号呈现出肿瘤细胞形态特征, 给结果判定提供可靠的依据。CellSearch检测CTC方法已经被FDA批准用于转移乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌等癌症患者的临床预后效果评估。国内外报道了很多CellSearch检测CTC在肺癌方面的研究[4]。近年来, 也有研究报道了CellSearch检测乳腺癌等患者CSF中的恶性肿瘤细胞[5, 6, 7]。本研究尝试运用CellSearch检测肺癌疑似脑转移患者CSF中的恶性肿瘤细胞, 探讨该技术做为一种辅助诊断LM方法的可行性, 从而有助于患者尽早确诊LM尽早接受治疗。

1 研究对象和方法
1.1 研究对象

纳入2014年8月至2016年8月期间广东省人民医院肺科确诊非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者21例, 男性9例, 女性12例, 全部病理类型为腺癌。20例患者有明确的临床症状, 主要表现为持续性头痛（6例）、头晕（12例）、视觉障碍（2例）、听觉障碍（3例）、嗅觉障碍（1例）和/或恶心呕吐（3例）等神经症状。影像学检测结果均未发现腰椎穿刺禁忌证, 并结合临床评估可行腰椎穿刺收集CSF; 患者及其家属签署知情同意书。

1.2 研究方法

按照临床常规进行腰椎穿刺, 采集CSF10~15 mL, 其中5~7.5 mL储存于CellSearch检测专用管CellSave管室温保存, 最长可保存96小时; 5~7.5 mL储存于玻璃干燥管送病理科进行细胞学检查; 2 mL储存于干燥管送检验科进行生物化学检测。颠倒混匀CellSave管中的CSF, 取5~7.5 mL加入专用锥形离心管用于CellSearch上机检测, 加入稀释缓冲液后离心, 上机前要在锥形离心管外壁底部贴上3~5 cm宽的黑色标签纸用来模拟血细胞层高度以供仪器拍照检查, 只有这个步骤通过仪器才能进行检测。CellSearch CTC Kit（Epithelial）（Janssen Diagnostics, LLC, Raritan, NJ）的检测原理是基于纳米磁微粒聚合物层上涂覆有针对EpCAM抗原的特异性抗体, 以捕获CTC; 在免疫磁体完成捕获并富集之后, 添加荧光抗体（CK-PE、DAPI和CD45-APC）以识别CTC; CellTracks Analyzer Ⅱ 分析仪自动扫描拍照所有荧光信号, 以图片方式呈现给检测者判读并计数CTC。送检病理科的CSF 5~7.5 mL按照病理细胞学常规方法进行柏氏液基细胞学制备和评价。在离心沉淀后, 取沉渣制片后进行新亚甲蓝染色, 显微镜下检查整张涂片是否有恶性肿瘤细胞, 病理结果由有经验的2名病理科医生评估给出。送检验科的2 mL CSF主要检测白细胞数、红细胞数、葡萄糖含量、氯含量和微量蛋白含量。应用SPSS17.0软件、McNemar Test方法进行统计分析。

2 结 果

21例患者全部为腺癌（NSCLC）, 其中20例均为Ⅳ 期患者并存在远处转移病灶：脑膜转移11例, 脑转移8例, 骨转移11例, 腹膜淋巴结转移2例, 肝转移1例, 肾上腺转移1例, 胸膜转移1例。CellSearch系统肿瘤细胞的判定准则是：上皮细胞表面标准物（CK-PE）和细胞核染料（DAPI）两者阳性, 并且白细胞标准物（CD45-APC）和Blank Channel都阴性的细胞事件; 细胞形状为圆形或椭圆形, 大小为至少4微米的完整细胞, 细胞核的面积小于细胞质的面积, 至少50%细胞核处于细胞质内。20例患者在第一次腰椎穿刺留取的CSF用CellSearch CTC Kit（Epithelial）检测全部找到恶性肿瘤细胞, 每1 mL CSF里找到2.9~1985.1个恶性肿瘤细胞（见图1）, 检出率100%; 同时送检病理科用液基细胞学方法找肿瘤细胞, 有12例（60%）找到肿瘤细胞。另外1例为Ⅰ A期患者作为阴性对照, 该患者没有表现出临床神经症状, 影像学MRI结果未发现转移病灶, 并且其CSF里没有找到恶性肿瘤细胞。具体数据见表1。两种方法检测结果的一致性见表2。在检测CSF出现恶性细胞的能力方面, CellSearch检测结果与液基细胞学方法比较差异有统计学显著性意义（P=0.008）。

CSF常规、生化检查：其中有1例未进行检查。CSF白细胞计数：> 8× 106/L 15例（75%）; CSF红细胞检查有7例（35%）发现红细胞, 0~3/HP 5例, 4+/HP 2例; CSF葡萄糖检测：< 2.5 mmol/L 9例（45%）, 最低0.84 mmol/L; CSF氯检测：< 120 mmol/L 11例, 最低81.5 mmol/L; CSF微量蛋白检测：> 450 mmol/L 11例（55%）, 最高8 312 mmol/L。

图1 CellSearch 系统中CellTracks AnalyzerⅡ 分析仪扫描恶性肿瘤细胞的阳性事件

表1 21 例患者第一次腰穿时CSF 检查结果
表2 CellSearch 与液基细胞学检测结果的一致性
3 讨 论

肺癌脑或脑膜转移的主要诊断方法有CSF的TCT液基细胞学和MRI等影像学。液基细胞学的检出率可能由于CSF的量或细胞的含量等因素受到影响。针对癌症上皮细胞的新的高敏感而特异性的方法可能会提高检出率。EPCAM、CK8/18/19等分子标记的CTC方法是近年来出现的一种上皮细胞分析方法, 在乳腺癌、前列腺癌、肠癌等瘤种已经获得批准应用于预后判断[8]。

在本研究中, 对入组的21例NSCLC患者疑似脑膜转移进行研究, 运用CellSearch系统和CellSearch CTC Kit（Epithelial）检测CSF里的恶性肿瘤细胞, 探讨该方法在辅助诊断NSCLC患者脑膜转移过程中的作用, 并与CSF液基细胞学检查进行比较。我们发现运用CellSearch系统和CellSearch CTC Kit（Epithelial）可以检测CSF里的恶性肿瘤细胞。20例入组的存在临床神经症状的NSCLC患者, 运用CellSearch系统检测第一次腰穿收集的CSF全部找到CSF肿瘤细胞, 检出率100%; 同时用液基细胞学方法查找CSF里的肿瘤细胞只有12例（60%）。在辅助诊断LM方面, 传统的液基细胞学检查方法存在一定的漏检率, 而运用CellSearch系统检测CSF能够弥补这方面的缺陷, 提高阳性率。从表1我们可以看出其中5名患者每1 mL的CSF里找到的CSF肿瘤细胞都少于21个, 而用液基细胞学方法检查CSF都没有找到肿瘤细胞。这提示在CSF细胞数量少的情况下, 液基细胞学方法可能由于制片过程损失而检出率低或检测不到, 本研究中送检的10 mL CSF里含有的肿瘤细胞数量约少于210个时不能被检出。相对而言, 敏感的CTC方法捕获少量的上皮细胞而弥补这种不足。运用CellSearch系统检测CSF里的肿瘤上皮细胞, 该方法敏感性高, 其可以在7.5 mL全血里检测到少至1个确认的EpCAM、CK阳性的肿瘤细胞。该方法的技术特异性很高, 不仅探测EPCAM的上皮标志物, 以荧光信号照片呈现出客观的肿瘤细胞形态供检测者判读并且可以计算数量, 结果因分子标志物与细胞形态综合判断而可靠。因此, 在脑膜转移癌的诊断中, 运用CellSearch系统检测CSF肿瘤细胞对比液基细胞学检查可能更具优势, 能够更早、更及时地给临床医生提供可靠的LM诊断依据, 让患者更早得到治疗, 延长生存时间。

综上, 本研究初步验证了CellSearch系统检测CSF肿瘤细胞的可行性, 证明该方法在辅助诊断脑膜转移癌中更加可靠, 可以作为一种新的诊断方法, 能够在LM转移早期发现CSF肿瘤细胞, 让患者在脑膜癌转移病灶形成前或早期接受治疗, 更早获益。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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