引用本文
陈新群, 徐丽姝, 李东风, 邓卫平. GLP-1对胆碱缺乏氨基酸饮食介导的非酒精性脂肪肝肝纤维化大鼠的治疗作用.循证医学, 2016,17(3): 163-170
CHEN Xin-qun, XU Li-shu, LI Dong-feng, DENG Wei-ping. Effects of Glucagon-Like Peptide-1 Analog on CDAA Diet-Induced Models of Nonalcoholic Fatty Liver Fibrosis in Rats. Journal of Evidence-based Medicine, 2016,17(3): 163-170  
Doi:10.12019/j.issn.1671-5144.2017.03.012
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GLP-1对胆碱缺乏氨基酸饮食介导的非酒精性脂肪肝肝纤维化大鼠的治疗作用
陈新群1,2, 徐丽姝1,2, 李东风2, 邓卫平2
1. 南方医科大学, 广州 510515
2. 广东省人民医院消化科、广东省医学科学院、广东省老年医学研究所, 广州 510080
通讯作者:徐丽姝, Tel： 020-83827812; E-mail： xulishu70@163.com

作者简介: 陈新群（1990-）,女,广东汕头人,在读硕士研究生,研究方向为消化系统疾病。

基金:广东省省级科技计划资助项目（2014A070705012）
摘要

目的 观察胰高血糖素样肽1类似物（利拉鲁肽）对非酒精性脂肪肝肝纤维化大鼠的治疗效果。方法雄性SD大鼠63只随机分为两组,其中对照组21只予含胆碱的氨基酸饮食喂养,另一组42只予缺乏胆碱的氨基酸饮食建立非酒精性脂肪肝肝纤维化大鼠模型,第10周末处死对照组大鼠1只,处死缺乏胆碱的氨基酸饲料组大鼠2只,Masson胶原染色肝组织确定造模成功后,缺乏胆碱的氨基酸饮食组随机分为两组：治疗组（20只）予利拉鲁肽注射液经腹腔注射,模型组（20只）予等体积的生理盐水经腹腔注射。分别以造模成功后的第 2、4、6、8 周为时间点,检测各组大鼠的体质量、肝指数、转氨酶、肝纤维化指标及肝组织Masson染色结果。结果三组大鼠体质量均呈进行性增长,治疗2周后,治疗组的体质量开始较模型组下降（F=3.407 9,P=0.006）,而肝重量和肝指数下降不明显（F=2.103 1,P=0.059;F=0.425 5, P=0.679）;给药4周后治疗组肝重量较模型组有明显下降（F=3.543 6,P=0.004）,给药6周后治疗组肝指数较模型组明显下降（F=15.403 1,P=0）;治疗2周开始治疗组谷草转氨酶比模型组有明显下降 （F=2.815 7,P=0.017）,治疗过程中治疗组谷丙转氨酶水平虽较模型组降低但不明显;治疗2周后治疗组血清透明质酸较模型组降低（F=3.454 5,P=0.014）,治疗4周后治疗组Ⅲ型前胶原蛋白含量较模型组降低（F=11.797 4,P=0）;随着缺乏胆碱的氨基酸饮食喂养时间的延长, Masson染色及光镜观察肝组织病理学显示大鼠肝脏脂肪变性及肝纤维化程度逐渐加重,治疗4周开始,纤维组织增生较模型组减轻（F=3.674 2,P=0.003）,差异有统计学意义,肝脏细胞的变性较轻,随着治疗时间的延长,纤维化进一步改善。结论缺乏胆碱的氨基酸饮食可诱导大鼠肝脏出现脂肪肝变,甚至肝纤维化;随着治疗时间的延长,胰高血糖素样肽1类似物利拉鲁肽可以改善这一病理生理过程甚至逆转早期肝纤维化。

关键词: 胰高血糖素样肽1; 非酒精性脂肪肝肝纤维化; 缺乏胆碱的氨基酸饮食; 肝纤维化指标; Masson染色
中图分类号:R575.5;R332 文献标识码:A 收稿日期:2017-04-05
Effects of Glucagon-Like Peptide-1 Analog on CDAA Diet-Induced Models of Nonalcoholic Fatty Liver Fibrosis in Rats
CHEN Xin-qun1,2, XU Li-shu1,2, LI Dong-feng2, DENG Wei-ping2
1. Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
2. Department of Gastroenterology,Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong Provincial Institute of Geriatrics, Guangzhou 510080, China
Abstract

Objective To investigate the protective effects of glucagon-like peptide-1 （GLP-1） on Nonalcoholic fatty liver fibrosis（NAFLF） rats.Methods Sixty-three male SD rats were randomly divided into 2 groups, one of them（n=21） were fed with choline-supplemented L-amino acid-defined diet （CSAA） for the whole experiment process. Another group （n=43） were fed with choline deficent aminoacid-defined diet （CDAA） as the modeling group, and at the end of the tenth week, one of the CSAA group and two of the modeling group were sacrificed to confirm the modeling success, then the modeling group was divided randomly into 2 equal groups, both continued with CDAA diet, but one of the group were given with intraperitoneal injection of Liraglutide （GLP-1, administered in the later 8 weeks）, using saline as a control. The rats were sacrificed at the 2nd、4th、6th、8th week of the intervention process respectively to obtain blood samples and liver tissues for analyzing the levels of serum aminotransferase （ALT）, aspartate transferase （AST） using an automatic biochemical analyzer and the levels of liver fibrosis indexes such as hyaluronic acid （HA） and type Ⅲprocollagen （PCⅢ） in serum and α-SMA in the liver tissues by ELISA or radioimmunoassay. TLR4 and NF-κB protein levels in the liver tissues were detected by Western blot.Results All rats get a weight gain during the period. Compared with CDAA group, CDAA+GLP-1 group showed significantly decreased of body weight （F=3.407 9, P=0.006）and serum levels of AST （F=2.815 7, P=0.017）, while liver weight had no significant decrease until the end of the 4th week（F=2.103 1,P=0.059）, so did the serum levels of PCIII（F=11.797 4,P=0）, and the serum HA level decreased significantly at the end of the 2nd week （F=3.454 5, P=0.014）, liver index decreased significantly at the end of the 6th week（F=0.425 5, P=0.679）. Though serum levels of ALT of the CDAA+GLP-1 group decreased compared to the CDAA group, the difference was not significant（P>0.05）. Continous feeded with CDAA diet aggravated the liver steatosis and fibrosis, the pathological situation began to improve sinificantly after 4 weeks’ treatment with GLP-1 analog（F=3.674 2, P=0.003）.Conclusion CDAA diet can induce NAFLF rat model, while Liraglutide, the GLP-1 analog can reduce CDAA diet-induced hepatic fibrosis, improve liver function, suggesting its potential as a therapeutic agent for early liver fibrosis.

Key words: glucagon-like peptide-1; non-alcoholic fatty liver fibrosis; choline deficent aminoacid-defined （CDAA） diet; liver fibrosis index; Masson staining

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）的病理过程包含了单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化。近20年, NAFLD的发病率稳步增长, 有研究指出这与代谢综合征的发病增加有关[1]。以往认为NAFLD是良性的, 但最近有研究表明约40%的NAFLD患者在4~13年后可进展至肝纤维化[2, 3], 通过生活方式干预达到体质量减轻是目前治疗NAFLD的一线治疗选择, 但由于患者一般无明显的临床症状, 很难意识到减体质量的必要性, 因此很难坚持。药物治疗方面如维生素E、吡格列酮和二甲双胍均有证据表明其对NAFLD有改善作用, 其有效性及安全性仍有待进一步研究。胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）是在回肠末端和结肠近端的L细胞分泌的肠促胰素[4], 在代谢进程中起多种作用, 包括血糖浓度依赖模式刺激胰岛素分泌, 延迟胃排空, 减少摄食量, 并通过神经机制促进糖分解[5]。利拉鲁肽是其类似物, 有研究指出其除了模拟以上生物行为[6], 还能改善实验动物模型的肝功酶、氧化应激水平以及肝脏脂肪变性[7, 8], 这可能与其能减轻体质量有关。目前针对GLP-1对非酒精性脂肪肝纤维化（nonalcoholic fatty liver fibrosis, NAFLF）治疗的研究甚少, 本实验通过缺乏胆碱的氨基酸（choline deficent aminoacid-defined, CDAA）饮食建立NAFLF SD大鼠模型, 观察利拉鲁肽治疗后大鼠肝功能、肝纤维化指标以及病理学形态改变, 探讨GLP-1对NAFLF的治疗作用。

1 材料与方法
1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠 63只, 体质量（120± 10）g, 购自广东省医学实验动物中心, 动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002; 实验动物合格证编号：No.44007200026932。

1.2 主要试剂

CDAA饲料及含胆碱的氨基酸（choline-supplemented aminoacid-defined, CSAA）饲料购自江苏南通特洛菲饲料有限公司; 利拉鲁肽购自丹麦诺和德公司; 透明质酸（hyaluronic acid, HA）、Ⅲ 型前胶原蛋白（type Ⅲ procollagen, PCⅢ ） ELISA试剂盒均购自广东鑫邦生物科技有限公司。

1.3 动物造模

雄性SD大鼠63只, 用普通饲料喂养1周后随机分为CDAA饮食组（n=42）、CSAA饮食组（n=21）, 每5~6只分一笼, 自由摄食饮水。10周末随机抽取1只CSAA饮食组大鼠1只和CDAA饮食组大鼠2只, 予麻醉后处死。取肝组织切片, 通过Masson染色见CDAA饮食组有肝窦状纤维化, 确认大鼠NAFLD肝纤维化模型制备成功。CSAA饮食组（n=20）继续CSAA饮食作为对照组, CDAA饮食组分为治疗组（n=20）予CDAA饮食+利拉鲁肽 0.6 mg/（kg· d）腹腔注射、模型组（n=20）予CDAA饮食+等体积生理盐水腹腔注射, 共干预 8周。治疗过程中, 观察大鼠的体质量变化及胃纳排便、毛发和活动情况, 给药剂量按体质量变化调整。分别于造模成功后第 2、4、6、8 周, 禁食 12 小时后称重并予水合氯醛溶液腹腔麻醉, 每组每次处死5只大鼠, 心脏采血, 每只大鼠采血10 mL分2份平均置于5 mL干燥管中, 分离血清。采血后快速完整剥离肝脏, 生理盐水漂洗并用滤纸吸干, 称量肝湿重, 用10%甲醛溶液固定24 h后制片行HE染色和Masson染色检查。

1.4 大鼠体质量、肝湿重及肝指数

称量体质量和肝湿重, 肝指数（%）=肝湿重/体质量× 100%。

1.5 血清生化指标检测

从心脏采血10 mL, 每5 mL分装于普通干燥试管, 以3 000 r/min离心15 min, 提取上层血清液至事先标记好的1.5 mL EP管中, 使用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶（alanine transaminase, ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase, AST）水平。

1.6 血清纤维化指标的检测

使用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清HA、PCⅢ 含量。

1.7 病理学检查

取大小约0.5 cm× 0.5 cm× 0.5 cm的肝组织, 用10%中性甲醛固定24 h, 石蜡包埋、切片, Masson染色, 光镜下观察肝脏的形态学改变, 依据肝纤维化病理 Ishak 评分标准, 对各组大鼠肝纤维化程度进行评分, 见表1[9]。

表1 肝纤维化病理Ishak 评分标准
1.8 统计学处理

使用IBM SPSS 20.0统计软件进行分析。

①服从正态分布的计量资料采用单因素方差分析, 用M（均数）± SD（标准差）表示, P< 0.05为差异有统计学意义。其中方差齐者采用LSD检验法进行组间两两比较, 方差不齐者使用近似方差分析Welch法和Brown-Forsythe法, 用Dunnett’ s T3法进行组间多重比较, P< 0.05为差异有统计学意义。

②不服从正态分布的资料和等级资料采用Kruskal-Wallis H（K）非参数检验法进行分析, 若P< 0.05则差异有统计学意义, 再采用Mann-Whitney U法做两两比较, P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 大鼠的一般情况

实验过程中CSAA饮食组大鼠好动, 皮毛整洁, 大便棕黑色成形; CDAA饮食组毛发黄腻凌乱, 温顺、懒动且行动迟缓; 治疗组一般情况介于二者间。实验结束时, 正常组大鼠死亡1只, 模型组死亡1只, 治疗组无死亡。

2.2 大鼠的体质量及肝指数

给药2周后, 治疗组的体质量开始较模型组下降（P< 0.05, 见表2和图1）, 而肝湿重和肝指数下降不明显（P> 0.05, 见图2和图3）, 给药4周后治疗组肝湿重较模型组有显著下降（P< 0.01, 图2）, 给药6周后治疗组肝指数较模型组降低且差异有统计学意义（P< 0.01, 见图3）。给药至8周末治疗组体质量较模型组平均下降15.6%。见表2。

表2 各组大鼠的体质量、肝湿重和肝指数

图1 各组大鼠的体质量变化情况

图2 各组大鼠的肝湿重变化情况

图3 各组大鼠的肝指数变化情况

2.3 大鼠生化指标

大鼠血清AST含量, 给药2周开始治疗组比模型组有明显下降 （均P< 0.05）, 差异有统计学意义; 在给药过程中ALT水平虽有降低, 但差异无统计学意义, 见表3。

表3 各组大鼠的血清转氨酶水平
2.4 对肝纤维化指标的影响

与模型组比较, 治疗组治疗2周后血清HA已出现下降（P< 0.05）, 差异有统计学意义。治疗4周后PCⅢ 含量开始降低（P< 0.05）, 差异有统计学意义, 见表4。

表4 各组大鼠的肝纤维化指标
2.5 肝组织胶原纤维染色

对照组： 肝细胞索以肝小叶的中央静脉为中心呈放射状排列, Masson染色仅于汇管区见到少量的纤维组织。模型组： 肝细胞呈现变性、坏死和再生等形态, 持续的CDAA饮食使SD大鼠肝脏脂肪变性及炎症反应程度逐渐加重, 并出现肝纤维化, 持续的CDAA饮食至第18周末肝脏病变以早中期纤维化为主。治疗组： 治疗4周开始, 纤维组织增生较模型组减轻（P=0.003）, 差异有统计学意义, 肝细胞的变性较轻, 随着治疗时间的延长, 纤维化进一步改善。各组大鼠在不同时间点Masson染色图像见图4~图7（放大倍数200）, Masson染色大鼠肝纤维化评分见图8和表5。

图4 2 周末各组大鼠Masson 染色图像

图5 4 周末各组大鼠Masson 染色图像

图6 6 周末各组大鼠Masson 染色图像

图7 8 周末各组大鼠Masson 染色图像

图8 各组大鼠肝纤维化评分比较

表5 Masson 染色大鼠肝纤维化评分
3 讨 论

在世界范围来讲, NAFLD已经成为肝病最常见的原因, 且正快速成为肝移植的主要病因。近年来, 人们已经逐渐发现非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）与人类罹患心脏病、肿瘤以及肝硬化等疾病有密切相关。尽管有研究表明噻唑烷二酮类药物、维生素E以及己酮可可碱可以改善肝脏脂肪的变性, 但对于NASH进程中的肝脏纤维化, 目前仍然无确切疗效的药物。我们已知肝纤维化存在可逆性, 因此, 为了阻止肝硬化形成, 应在肝脏纤维化的早期阶段即予干预以逆转该不良进程。

GLP-1是一种肠促胰素, 是食物摄入时在小肠L细胞产生和分泌的 [4]。GLP-1能血糖依赖性促进胰岛素分泌, 还能抑制胰高血糖素在体内的释放, 除此之外, GLP-1尚通过多种作用参与机体代谢, 如降低受治者的食欲, 并使胃排空减慢, 还能诱导胰腺β 细胞增殖[10]。人工合成的GLP-1受体激动剂（如利拉鲁肽）可用于治疗2型糖尿病, 可单药治疗也可用于联合治疗 [11, 12]。在低血糖时利拉鲁肽能减少胰岛素分泌, 且不影响胰高糖素的分泌, 使血糖停留在平稳的范围, 将低血糖发生的风险降至最低。GLP-1受体是G蛋白偶联受体, 也包括胰高血糖素受体、GLP-2和胃抑制多肽（GIP）。在啮齿类动物和人类, GLP-1受体已被发现在广泛的组织中表达, 包括胰岛细胞、肾、心、肺、肠、外周和中枢神经系统。最近, Gupta等的研究表明, GLP-1受体 mRNA和蛋白存在于原代人肝细胞和培养的啮齿类动物肝细胞[13]。

本研究通过CDAA饮食喂养建立 NAFLD 肝纤维化大鼠模型, SD大鼠在10周CDAA饮食喂养后, 成功建立NAFLD肝纤维化的动物模型, 表现出AST及ALT升高, 肝纤维化指标升高, 肝组织切片Masson染色见窦周纤维化。利拉鲁肽治疗共8周, 每2周处死各组大鼠5只, 可见随着治疗时间的延长, 肝血清中ALT、AST水平逐渐下降, 第6周末开始AST水平降至与对照组无显著差异, 至第8周血清中AST水平与对照组无明显差异。持续的利拉鲁肽治疗, 大鼠的肝纤维化指标呈下降趋势, 第4周开始即可见HA及PCⅢ 水平与对照组相近。GLP-1类似物利拉鲁肽的治疗作用, 一方面与其抑制胃纳、减少摄食有关, 另一方面可能与该药能改善胰岛素抵抗以及通过某些信号通路启动抗炎反应从而逆转肝纤维作用有关, 这值得进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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