PD-1是表达在T细胞表面的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白, 主要在活化的T细胞表面表达。PD-1有PD-L1和PD-L2两个配体。与PD-L2相比, PD-L1的表达范围更宽, 在体内的作用更强。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达, 且许多癌组织中的PD-L1表达水平较正常组织的明显高。对于PD-L1的表达有不同的定义, 包括≥ 1%肿瘤细胞表达PD-L1或≥ 5%肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)表达PD-L1^{[3, 4, 5]}。目前研究较多的PD-1拮抗剂是Pembrolizumab和Nivolumab, PD-L1拮抗剂包括Avelumab和Atezolizumab。

Pembrolizumab在多种肿瘤中均获得良好的疗效, 已被美国FDA批准用于黑色素瘤的治疗, 在乳腺癌研究中也取得了一定成效。Ⅰ B期临床研究KEYNOTE-012主要探索Pembrolizumab单药治疗转移性乳腺癌(metastatic breast cancer, MBC)的疗效, 65/111例(58.5%)患者为PD-L1+, 32例患者入组并接受Pembrolizumab治疗。在27例可评估的患者中, 1例达到完全缓解(complete response, CR), 1例部分缓解(partial response, PR), 5例患者病情稳定(stable disease, SD), 客观缓解率(objective response rate, ORR)为18.5%。中位总生存期(overall survival, OS)为10.2个月, 1年总生存率为41.1%^[6]。Ⅱ 期临床研究KEYNOTE-086将接受Pembrolizumab单药治疗的晚期三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)患者分别纳入两个队列, 队列A为既往接受过治疗的晚期TNBC患者, 不论PD-L1表达量; 队列B为PD-L1+未接受过晚期一线治疗的TNBC患者。队列A中62%患者为PD-L1+, 超过40%患者既往接受过三线及以上治疗。该研究表明队列B患者的ORR为23.1%, 明显高于队列A(5%), 因此该研究表明Pembrolizumab在一线和PD-L1+的晚期TNBC患者中疗效最佳^{[3, 4]}。

Avelumab的Ⅰ 期JAVELIN临床研究探索不同剂量Avelumab治疗实体瘤的疗效, 其中入组患者中34.5%为TNBC患者, 超过半数患者接受过三线及以上治疗。总人群的ORR为4.8%, 而TNBC亚组达8.6%。在136例评估过PD-L1的患者中, PD-L1≥ 10%及< 10%两组患者的部分缓解率分别为33.3%和2.4%。在44例已评估PD-L1的TNBC亚组中, PD-L1≥ 10%及< 10%两组患者的ORR分别为44.4%和2.6%, 可见无论在总人群还是在TNBC亚组, PD-L1+亚组效果更佳。目前正在进行的Ⅲ 期临床研究评估高危早期乳腺癌患者常规治疗后加用1年Avelumab的疗效(NCT02926196)^[7]。

因此综合来看, PD-1和PD-L1拮抗剂主要用于PD-L1+的TNBC患者疗效较好, 对MBC患者一线用药比二线及以上用药效果更佳。

CTLA-4(CD152)是由CTLA-4基因编码的一种跨膜蛋白质, 表达于活化的CD4+和CD8+T细胞, 与T细胞表面的协同刺激分子受体CD28具有高度的同源性, 两者竞争结合其配体CD80(B7-1)或CD86(B7-2), 这类配体主要由包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达。CTLA-4与其配体结合后抑制T细胞激活, 使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击^{[2, 6]}。Yu等发现间质组织中CTLA-4+ T细胞高水平表达及肿瘤细胞中CTLA-4低水平表达预示着更好的无进展生存期(progress-free survival, PFS)和OS, 这表明T淋巴细胞CTLA-4表达预示更好预后, 而肿瘤细胞CTLA-4表达预示着预后较差^[8]。

CTLA-4拮抗剂通过阻断CTLA-4的免疫效应刺激免疫细胞增殖, 进而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。目前研究较多的CTLA-4拮抗剂包括Tremelimumab和Ipilimumab。Vonderheide等在Ⅰ 期临床试验中发现, Tremelimumab联合依西美坦可使26例ER+/HER2-乳腺癌患者中的11例病情稳定12周或更长, 最佳ORR为42%。研究发现多数患者血清中CD4+和CD8+T细胞表达诱导性共刺激因子(inducible costimulator, ICOS)水平及ICOS+ T细胞/FoxP3+ Treg细胞比例明显上升, 表明CTLA-4信号通路成功阻断。安全性分析显示Tremelimumab耐受性良好, 主要不良反应包括腹泻和血清转氨酶升高^[9]。CTLA-4拮抗剂在乳腺癌治疗的研究尚不成熟, 目前已有多个正在进行的临床研究探索CTLA-4拮抗剂联合化疗或PD-L1抗体治疗乳腺癌的疗效, 期待这些研究的结果(NCT02563925、NCT02658214、NCT03546686)。

为了使免疫治疗发挥最大的疗效, 目前有许多研究着重探索免疫治疗联合化疗、抗HER2靶向治疗、聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制剂及其他免疫治疗等联合治疗模式的疗效和安全性。

化疗不仅具有细胞毒作用, 而且能够通过释放细胞因子和肿瘤特异性抗原(tumor associated antigens, TAAs)来诱导机体产生免疫反应^[10]。因此, 化疗与ICPI联合可能有协同作用, 这一设想已被许多临床前研究证实^{[11, 12]}。第一个探索两者联合治疗乳腺癌的临床研究是Atezolizumab联合白蛋白紫杉醇治疗晚期TNBC的Ⅰ B期临床研究, 作为一线和二线及以上用药的ORR分别为46%和38%, 提示一线用药可能比二线及以上用药效果更佳^[11]。Loibl等在2018美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)年会上报道了一项探索紫杉-蒽环化疗方案基础上联合PD-L1拮抗剂Durvalumab新辅助治疗TNBC的一项随机Ⅱ 期临床研究(GeparNuevo) 。该研究共纳入174例TNBC患者, 在活检确诊后试验组和对照组分别接受Durvalumab靶向治疗和安慰剂治疗持续2周(窗口期), 治疗2周后再次行空心针活检, 因此通过两次活检标本可获得靶向治疗前后肿瘤标志物的状态。第二次活检后试验组和对照组再分别接受Durvalumab+白蛋白紫杉醇和安慰剂+白蛋白紫杉醇治疗, 维持12周达到临床缓解后, 再接受表柔比星+环磷酰胺(EC)+Durvalumab和EC+安慰剂治疗, 维持8周后行手术治疗。结果表明与对照组相比, 加用Durvalumab的试验组可使TNBC患者的病理完全缓解率(ypT0N0)提高10%(43.2% vs. 53.4%, 比值比=1.53, P=0.28)^[13]。虽然目前的研究结果提示化疗联合ICPI用于晚期一线较多线治疗效果更好, 但也有越来越多的研究探索两者联合应用在新辅助及辅助治疗阶段的可能。

曲妥珠单抗具有内在免疫调节能力, 可介导抗体依赖的细胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), 促进HER2特异性T细胞反应^[14]。临床前研究表明免疫介导的曲妥珠单抗耐药可被ICPI逆转^[15]。动物实验表明曲妥珠单抗样抗体联合PD-1拮抗剂可显著增强药物对HER2+肿瘤的杀灭能力, 且对比单用曲妥珠单抗或免疫治疗, 两者联合能延迟> 90%小鼠的生存期^[16]。目前已有多项临床研究旨在探索抗HER2靶向治疗联合PD-1/PD-L1拮抗剂治疗HER2+的局部晚期乳腺癌(locally advanced breast cancer, LABC)或MBC患者。

基础研究表明PARP抑制剂联合抗PD-1抗体具有协同作用, 这可能是由于PARP抑制剂治疗导致的DNA修复失败和细胞质DNA异常, 进一步活化干扰素基因刺激通路(STING), 而该通路活化导致Ⅰ 型干扰素的表达和释放, 进而引起γ 干扰素的降低和肿瘤内效应T细胞的浸润。在2018 ASCO年会上Vinayak等报道了KEYNOTE-162/TOPACIO研究的初步结果, 该研究利用PARP抑制剂Niraparib及Pembrolizumab联合治疗转移性TNBC。在46例可评价疗效的患者中, 3例(7%)CR, 10例(22%)PR, ORR及疾病控制率分别为28%和50%。且该联合方案在tBRCA野生型和突变型患者中均有效, 表明疗效与BRCA状态无关。截至今年6月, 8例有效的患者仍在接受治疗, 其中5例患者已持续获益1年以上。安全性分析表明, 该联合方案耐受性好, 除Niraparib在初始剂量200 mg可能引起血小板减少外, 无其他明显毒副作用, 在联合Pembrolizumab后也没有发现免疫相关的不良反应^[17]。

概览目前已有的临床研究数据, 我们发现PD-1/PD-L1拮抗剂目前仍主要应用于晚期TNBC或HER2+乳腺癌治疗当中。不同临床研究的疗效存在差异, 可能原因包括：样本量较小、PD-L1定义不一致、研究目标人群基线特征差异等^{[3, 4, 6, 7]}。因此, 期待更大样本量、统一标准的临床研究带来更多循证医学证据。虽然既往报道表明PD-1/PD-L1拮抗剂可能对转移性TNBC更有效, 但目前正在进行的临床研究试图在以下方面有所突破(见表1)：①联合其他治疗方法、扩大样本量、进一步开展Ⅲ 期临床研究; ②探索免疫治疗在不同分子分型、不同病理分型的乳腺癌患者中的疗效; ③探索免疫治疗在新辅助及辅助治疗阶段的疗效。

表1

表1

表1 正在进行的以PD-1/PD-L1拮抗剂为基础的联合方案相关的乳腺癌临床研究 研究药物 靶点 研究名称/注册号 联合方案 分期 研究方案性质 研究目标人群 Pembrolizumab PD-1 KEYNOTE-173 联合化疗 Ⅰ 新辅助治疗 TNBC KEYNOTE-522 联合化疗 Ⅲ 新辅助及辅助治疗 TNBC KEYNOTE-355 联合化疗 Ⅲ 姑息治疗 既往未经治疗的LABC/MBC NCT02752685 联合化疗 Ⅱ 姑息治疗 HER2- MBC Avelumab PD-L1 NCT03414658 联合化疗和靶向治疗 姑息治疗 HER2+ MBC ImmunoADAPT 联合CDK抑制剂 Ⅱ 新辅助治疗 ER+ 乳腺癌 Atezolizumab PD-L1 NCT02530489 联合化疗 Ⅱ 新辅助治疗 TNBC GELATO 联合化疗 Ⅱ 姑息治疗 晚期浸润性小叶癌 CDK: 细胞周期蛋白依赖性激酶, cyclin dependent kinase

表1 正在进行的以PD-1/PD-L1拮抗剂为基础的联合方案相关的乳腺癌临床研究

除了化疗、抗HER2靶向治疗, 免疫治疗还可联合放疗和冰冻消融等局部治疗, 双重ICPI, 或联合CDK4/6抑制剂等。这些联合治疗方案为我们提供了新的思路和方向, 但联合哪一类药物能以最小的副作用达到最佳的疗效仍需对免疫治疗的机制进行更深入的探索。

2.1.1 TILs是否可以预测新辅助或辅助化疗的疗效?

当人体的免疫系统成功识别肿瘤细胞表达的异常蛋白后就能启动肿瘤特异性免疫反应, 这类蛋白称为肿瘤特异性抗原^[18]。免疫细胞可浸润到肿瘤组织或肿瘤周围间质组织, 这类免疫细胞大部分为淋巴细胞, 被称为TILs。大量研究表明TILs可以作为乳腺癌患者新辅助治疗的疗效预测指标, TILs比例越高预示着病理完全缓解率越高^{[19, 20]}。就TNBC患者辅助化疗来说, 高比例TILs仍预示着化疗效果更好, OS更长, 预后更佳。但对于接受曲妥珠单抗治疗的患者来说, TILs能否预测曲妥珠单抗疗效仍存在争议^{[21, 22]}。

2.1.2 TILs与不同类型的乳腺癌预后关系如何?

一般认为TILs的存在提示人体对TAAs成功进行免疫识别。TNBC和HER2阳性型乳腺癌比Luminal型TILs比例更高, 对PD-1拮抗剂反应更好, 预后更佳^{[19, 20, 22, 23, 24]}。Adams等对ECOG临床研究E2197和E1199中506例TNBC患者连续随访10年, 发现TILs比例每上升10%, 可降低18%远处复发率(P=0.04)和19%死亡率(P=0.01)。多因素回归分析发现, TILs可作为无病生存期(disease-free survival, DFS)和OS的独立预后指标^[22]。Loi等发现对HER2阳性且接受曲妥珠单抗靶向治疗的患者, 高比例的TILs也会明显降低远处转移率^[22]。因此, 不同分子分型的乳腺癌患者在基线时TILs浸润情况不一, 对传统化疗的反应也可能存在不同的模式, 因此TILs对乳腺癌患者疗效预测及预后分析仍需要就分子分型进行亚组分析以获得更多生存数据。

既往研究表明PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫中起着重要的作用, PD-1和PD-L1结合后会传导共抑制性信号, 可以使T细胞的免疫活性受到抑制, 在免疫耐受中发挥重要作用, 同时也是肿瘤细胞免疫逃逸的重要原因。如果从根源上阻断PD-1/PD-L1信号通路的激活, 便可以增强抗肿瘤免疫治疗效应^[25]。

KEYNOTE-024研究表明Pembrolizumab治疗非小细胞肺癌的疗效与PD-L1的表达有关^[26]。PD-1/PD-L1单抗对于一系列肿瘤均有临床疗效, 且反应持久, 但只有部分患者有应答, 因此亟需筛选生物标志物来帮助发现目标获益人群^[27]。虽然PD-L1表达可以预测免疫治疗的疗效, 但以PD-L1表达水平作为预测性生物标志物存在诸多缺陷, 其表达可能因肿瘤生物学行为的不同(瘤内及瘤间异质性、表达细胞、染色部位)、组织来源不同(组织类型、组织标本质量、原发灶和转移灶的区别或组织获取困难)及检测技术的不同(不同检测抗体和平台、不同阈值、判读的主观性)而有所差异, 各种方法检测的不一致率高达50%。因此, 亟需多维度更精准的生物标志物补充免疫疗效的预测^[28]。

TMB是肿瘤标本中所评估的编码基因组每兆碱基中发生的体细胞编码碱基的置换、碱基插入及缺失突变的总数。体细胞突变可促进新抗原的产生, 新抗原增加T细胞的识别杀伤力, 促进免疫反应。TMB是从新抗原负荷增加的角度帮助预测免疫治疗的疗效。TMB检测的定量性质使其比通过免疫组化对蛋白生物标志物表达水平进行个体动态定性检测更为可靠, 免疫组化可因其固有的变异性, 难以成为准确的应答预测因子。免疫组化检测PD-L1与TMB仅部分重叠, 同时使用两种标志物可提高ICPI对肿瘤患者的选择效果, 更好地确定从免疫治疗中获益更大的患者^{[29, 30]}。Johnson等采用二代测序技术对PD-1/PD-L1经治的黑色素瘤患者标本进行DNA测序发现, 高TMB组的ICPI疗效显著优于低TMB组^[31]。TMB与ORR之间存在显著相关性(P< 0.001), 相关系数达0.74, 在包括乳腺癌在内的27种肿瘤中, 55%的ORR差异可用TMB来解释, 这些发现凸显了多种肿瘤中TMB与PD-L1单抗疗效之间的强相关性^[32]。

乳腺癌的发生发展涉及多基因突变, 而引起基因突变的主要诱因是DNA损伤。正常情况下人体存在一套能修复DNA碱基错配的酶分子安全保障体系, 称为DNA错配修复(DNA mismatch repair, MMR)系统^[33]。但研究发现MMR系统任一基因突变都可导致DNA复制精确性下降, 从而导致整个基因组不稳定。其中最易观察到的不稳定性表型即为MSI, 即由于复制错误引起的简单重复序列的增加或丢失^[34]。有研究表明, 存在MSI的肿瘤组织中与免疫检查点相关的蛋白明显上调, 包括PD-1和PD-L1。高MSI(MSI-high, MSI-H)和错配修复缺陷(MMR-deficient, dMMR)可以显著预测PD-1抑制剂Pembrolizumab治疗的疗效^{[35, 36]}。2017年5月23日美国FDA批准免疫药物PD-1抑制剂Pembrolizumab用于“ MSI-H/dMMR” 亚型的实体瘤患者, 这是FDA批准的第一个针对泛瘤种ICPI筛选的生物标志物。