引用本文
彭晓潇, 刘思思, 宋丹妮, 喻若颖, 周清. 非小细胞肺癌血浆外泌体PD-L1检测的可行性研究. 循证医学, 2019,19(2): 119-123.
PENG Xiao-xiao, LIU Si-si, SONG Dan-ni, YU Ruo-ying, ZHOU Qing. Feasibility Study on The Detection of Plasma Exosomal PD-L1 in Non-Small Cell Lung Cancer. Journal of Evidence-Based Medicine,2019,19(2): 119-123.  
DOI:10.12019/j.issn.1671-5144.2019.02.014
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非小细胞肺癌血浆外泌体PD-L1检测的可行性研究
彭晓潇1, 刘思思2, 宋丹妮2, 喻若颖2, 周清1
1. 华南理工大学附属广东省人民医院, 广州510080
2. 南京世和基因生物技术有限公司, 南京 210032
通讯作者: 周清, Tel：020-83827812-51221; E-mail：gzzhouqing@126.com
作者简介:

彭晓潇（1992-）,女,四川乐山人,在读硕士研究生,从事肺癌免疫治疗研究。

基金项目:国家自然科学基金资助项目（81871891）
摘要

目的 探究检测非小细胞肺癌血浆外泌体PD-L1（exosomal PD-L1,ePD-L1）的可行性,并明确其与肿瘤组织PD-L1表达水平的关系。方法 选取2种人肺腺癌细胞系H226（PD-L1弱阳性）、H1975（PD-L1强阳性）为实验组,1种人乳腺癌细胞系MCF-7（PD-L1阴性） 为对照组,细胞系培养后以超高速离心法分离细胞培养液中的外泌体,同时收集细胞裂解液,以外泌体特异性蛋白标志物CD9为标记,采用蛋白质免疫印迹法检测各细胞系释放的外泌体、PD-L1和ePD-L1含量,分析PD-L1与ePD-L1表达水平的相关性。结果 H1975和MCF7细胞系外泌体检测到较强CD9表达, H226细胞系分泌的外泌体CD9水平很低。MCF7、H226和H1975细胞系PD-L1表达水平分别为阴性、弱阳性、强阳性,ePD-L1表达水平分别为阴性、阴性、强阳性。结论 血浆ePD-L1水平受肿瘤组织本身PD-L1表达水平和其外泌体释放量的双重影响,ePD-L1表达呈阳性时,可反应肿瘤组织PD-L1表达水平;而ePD-L1检测呈阴性时,应以肿瘤组织PD-L1的检测结果为准。

关键词: 非小细胞肺癌; 外泌体; 程序性死亡受体-1; 程序性死亡受体-配体1
中图分类号:R734.2 文献标识码:A 收稿日期: 2019-03-14
Feasibility Study on The Detection of Plasma Exosomal PD-L1 in Non-Small Cell Lung Cancer
PENG Xiao-xiao1, LIU Si-si2, SONG Dan-ni2, YU Ruo-ying2, ZHOU Qing1
1.Guangdong Provincial People's Hospital Affiliated to South China University of Technology, Guangzhou 510080, China
2. Geneseeq Technology Inc., Nanjing 210032, China
Abstract

Objective The aim of this study was to investigate the potential of using plasma exosomal PD-L1 （ePD-L1） as a biomarker for non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods Two NSCLC cell lines, H226 （low-expressed PD-L1） and H1975 （high-expressed PD-L1） and one breast cancer cell line MCF7 （PD-L1 negative） were selected for this study. The exosomes secreted by cells into culture medium were separated by high-speed centrifugation, and the cell lysate was also collected. CD9 was used as a marker for exosomes detection. The exosome-released PD-L1 expression level and the ePD-L1 level were detected by Western Blot.Results H1975 and MCF7 cell lines showed stronger CD9 expression level compared to H226 cell line. H1975 cell line with stronger PD-L1 expression showed higher ePD-L1 level compared to H226 cell line. PD-L1 negative MCF7 cell line was also found to be ePD-L1 negative.Conclusion Plasma ePD-L1 expression is regulated by the expression level of PD-L1 in tumor cells and the secretion level of exosomes from tumor cells. ePD-L1 expression can be an indicator for the expression level of PD-L1 in tumor tissues.

Key words: non-small cell lung cancer; exosome; programmed death-1（PD-1）; programmed death-ligand1（PD-L1）

随着Pembrolizumab、Nivolumab、Atezolizumab等程序性细胞死亡受体-1（programmed death-1, PD-1）/程序性细胞死亡受体-配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）抑制剂系列研究结果的陆续公布, 免疫治疗获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准和美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南推荐（Ⅰ 类证据）, 成为晚期驱动基因阴性非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）一线治疗的选择之一, 但目前对一线免疫单药治疗仍严格限制在肿瘤组织PD-L1高表达[肿瘤比例分数（tumor proportion score, TPS）≥ 50%]的患者。

毋庸置疑, 肿瘤组织PD-L1表达水平是目前PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测的重要生物标志物之一。目前PD-L1检测采用肿瘤组织标本, 其取材方式属有创操作。此外, 肿瘤组织PD-L1表达水平本身存在时间和空间的异质性[1], 小的活检标本和手术切除标本诊断PD-L1表达水平的不一致率可达18%~48%[2, 3, 4]。

而外泌体直接来源于肿瘤细胞, 其表面可携带原始细胞的受体或配体。已有动物实验证明, 表达PD-L1的细胞可分泌同样携带PD-L1的外泌体[5]。目前, 外泌体PD-L1（exosomal PD-L1, ePD-L1）的研究刚刚起步, 刘云鹏教授团队的研究证明, 多种胃癌细胞系可以分泌ePD-L1, 其含量与细胞PD-L1的表达水平呈正相关, 并且与患者肿瘤T分期和免疫治疗的预后相关[6]。在头颈癌中也有其与免疫治疗预后相关的报道[7]。在肺癌领域, 尚未有ePD-L1与原肿瘤细胞PD-L1表达水平或与免疫治疗预后相关的报道。因此, 本研究旨在明确NSCLC血浆ePD-L1检测的可行性, 并探究NSCLC肿瘤细胞PD-L1与其ePD-L1表达水平的关系。

1 材料与方法
1.1 材料

人肺癌细胞系H226（PD-L1弱阳性）、H1975（PD-L1强阳性）、人乳腺癌细胞系MCF7（PD-L1阴性）均购于美国模式培养物集存库（American type culture collection, ATCC）。CD9兔多克隆一抗及PD-L1（28-8）兔多克隆一抗购于英国Abcam公司, 羊抗兔辣根过氧化物酶二抗购于美国LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

对照组为PD-L1表达阴性的人乳腺癌细胞株MCF7, 实验组为PD-L1表达弱阳性的H226和PD-L1表达强阳性H1975人肺腺癌细胞系。

1.2.2 细胞培养

MCF7细胞系培养基成分配比：10%胎牛血清, DMEM培养基, 100 U/mL 青霉素, 0.1 mg/mL链霉素。H226和H1975细胞系培养基成分配比：10%胎牛血清, RPMI 1640培养基, 100 U/mL青霉素, 0.1 mg/mL链霉素。培养条件：37℃, 5% CO2。3种细胞系分别培养于10 cm培养皿中, 同步扩大培养至6盘细胞量。

1.2.3 细胞培养上清液超速分离外泌体

收集细胞培养基上清液, 转移至50 mL离心管中; 离心机提前4℃预冷, 300 g离心20 min, 弃沉淀, 上清液转移至新的50 mL离心管中。4℃, 2 000 g离心20 min, 弃沉淀, 上清液转移至新的50 mL离心管中。4℃, 10 000 g离心30 min, 弃沉淀, 上清液转移至与超速离心配套的离心管内, 即获得外泌体原液。外泌体原液（不足时）用PBS缓冲液补充至标准体积（距离心管口1 cm左右）, 注意配平, 于超速离心机150 000 g离心70 min, 弃上清液。将离心后所得的外泌体沉淀用200 μ L PBS充分洗涤, 并补充至标准体积, 再次离心, 弃上清液。向外泌体沉淀物中加入细胞裂解液充分混匀, 冰上裂解10 min。将外泌体裂解液转移至新的1.5 mL离心管中。

1.2.4 细胞裂解、沉淀收集

向培养皿中加入PBS, 轻轻摇晃皿底, 洗去培养基残留。吸走PBS, 在皿底加入适量0.25％胰蛋白酶, 置于37℃消化至细胞变圆、脱离皿底。加入含有FBS的培养基终止消化, 并吹打混匀细胞。将细胞悬液转移至15 mL离心管中, 300 g离心5 min, 弃上清液。向细胞沉淀中加入适量PBS吹打洗涤, 再次300 g离心 5 min, 弃上清液。向洗涤后的细胞沉淀中加入细胞裂解液, 冰上混匀、静置30 min, 裂解细胞。离心机预冷至4℃, 8 000 g离心10 min, 将细胞裂解液上清液转移至新的1.5 mL离心管中。

1.2.5 蛋白定量

将蛋白定量BSA标准品按说明书倍比稀释。取外泌体及细胞裂解液10 μ L, 分别加入96孔板中, 每孔加入300 μ L G250染液。酶标仪读数, 计算标准曲线及样品浓度。每个样品至少2次重复。

1.2.6 Western Blot检测蛋白表达（PD-L1和外泌体膜蛋白标志物CD9）

配置12%的蛋白胶, 将ePD-L1与细胞沉淀PD-L1样品分别上样。采用湿转方式, 100 V转膜70 min, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h。将膜置于4℃摇床, 30~50 rpm, 一抗孵育过夜（一抗采用0.5%BSA稀释, CD9稀释比为1:500, PD-L1稀释比为1:100）。室温摇床, 30~50 rpm, 二抗孵育1 h（二抗采用0.5%BSA稀释, 稀释比为1:10 000）。按1:1比例配置ECL显色液, 将显色液均匀涂到膜表面, 避光反应1 min左右, 将膜置于Tanon自动曝光仪曝光。

1.2.7 结果判读

结合样品类型, 依据Western Blot条带强弱差异, 对外泌体PD-L1表达量进行判断。

2 结 果
2.1 各细胞系培养液检测到的CD9表达水平

同样量的细胞培养液进行超高速离心, 分离得到的外泌体蛋白量差异较大, 见表1。同时, H1975和MCF7细胞系外泌体样品中能检测到较强外泌体特异性蛋白标志物CD9, 但是H226分泌的外泌体CD9水平很低, 见图1。该结果证明各NSCLC细胞系均能分泌可被检测到的外泌体, 但外泌体量可能不同。

表1 外泌体及细胞沉淀蛋白上样量

图1 外泌体和细胞沉淀中三个细胞系的PD-L1和CD9表达水平

2.2 H1975细胞系PD-L1与其ePD-L1表达水平

H1975细胞系分泌的外泌体中可检测到PD-L1。同时, 此细胞系的细胞裂解液中也检测到高表达的PD-L1（图1）。以上结果初步证明, 高表达PD-L1的细胞系分泌的外泌体中可携带PD-L1。

2.3 H226细胞系PD-L1与其ePD-L1表达水平

H226细胞系的细胞裂解液中检测到了PD-L1, 但是表达水平较低, 其分泌的外泌体中没有检测到PD-L1（图1）。根据结果2.1, H226分泌的外泌体CD9水平很低。因此, ePD-L1阴性检测结果可能由细胞系本身PD-L1水平较低和其分泌的外泌体含量少共同导致。

2.4 MCF7细胞系PD-L1与其ePD-L1表达水平

MCF7作为阴性对照细胞系, 无论在细胞裂解液还是外泌体中均不能检测到PD-L1（图1）。

3 讨 论

PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂已成为晚期驱动基因阴性NSCLC患者的重要治疗选择之一。多项临床试验表明其在驱动基因阴性的PD-L1高表达（TPS≥ 50%）晚期NSCLC一线、二线治疗中优于传统化疗[8, 9, 10]。但并非所有PD-L1高表达的患者都能从抗PD-1/PD-L1治疗中获益, 甚至可能存在疾病超进展的风险[11]。有效免疫治疗的关键是筛选优势人群。

从机制上来说, PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂直接与肿瘤组织PD-L1或T细胞表面PD-1结合, 阻断肿瘤细胞PD-L1与T细胞表面PD-1结合, 从而恢复免疫系统的监视功能[12]。因此, PD-L1表达水平可能是重要的疗效预测标志之一。但由于其表达存在时间和空间异质性, 并且其检测需要侵入性手段来获取肿瘤组织, 造成了临床应用上的困难。外泌体直接来源于原肿瘤细胞, 带有原始细胞表面的受体或配体。在NSCLC中, 其是否能反映原肿瘤组织的PD-L1表达水平仍未确定。因此, 本研究明确了NSCLC血浆ePD-L1检测的可行性, 并在此基础上证明了PD-L1表达阳性的细胞系可释放携带的PD-L1外泌体。但由于其含量受细胞本身PD-L1表达水平和外泌体释放含量的双重影响, ePD-L1阴性检测结果可能由细胞系本身PD-L1水平较低和其分泌外泌体含量少共同导致。因此, 当PD-L1检测呈阴性, 应以肿瘤组织PD-L1的检测结果为准。

外泌体作为液体活检的一部分, 在癌症诊断和疗效监测方面具有巨大的潜力[13]。外泌体检测技术作为组织PD-L1检测补充的可行性及优势在于：第一, 外泌体起源于细胞膜的内陷, 其产生早期胞内体, 进一步发展成为多泡小体, 多泡小体在细胞内分子马达的牵引下与细胞表面融合, 最终分泌出去[14]。因此, 从理论上说, 外泌体具有原始细胞表面的受体或配体, 表达PD-L1的肿瘤细胞可分泌同样携带表达PD-L1的外泌体; 第二, 其广泛存在于患者的外周血中, 不需要通过有创的方式来获取肿瘤组织, 避免侵入性活检的风险, 同时可多次取样, 更有利于对疾病的动态检测; 第三, 外泌体检测从全身循环的血液中取材, 在一定程度上可以克服肿瘤异质性给检测带来的误差, 反映个体整体的免疫功能情况。

检测ePD-L1对于了解个体免疫微环境也存在优势。首先, ePD-L1本身具有活性, 可以和CD8+T细胞表面的PD-1直接结合, 从而抑制T细胞增殖并减弱它分泌细胞因子和杀伤肿瘤细胞的功能[15]。其次, 既往文献报道, 肿瘤微环境中游离形式的PD-L1除了ePD-L1还有可溶性PD-L1（soluble PD-L1, sPD-L1）[16]。而ePD-L1与sPD-L1相比, 其形式更稳定, 不易被蛋白水解酶水解, 可更强烈地诱导T细胞凋亡[6]。

在2017年Theodoraki教授对头颈部肿瘤的研究中, ePD-L1水平被证明与疾病的分期、淋巴结转移和疾病的活动情况相关。阻断ePD-L1与PD-L1阳性T细胞的结合可以减轻免疫抑制[7]。随后在对胃癌患者的研究中, 刘云鹏教授团队证实多种胃癌细胞系可以分泌ePD-L1, 其含量与细胞PD-L1的表达呈正相关, ePD-L1高表达胃癌患者的总生存期短于低表达组（20.73个月 vs.28.8个月, P=0.021）, 并且ePD-L1可诱导T细胞凋亡[6]。在转移性黑色素瘤的患者外周血中也同样检测到ePD-L1, 其表达水平与干扰素-γ 水平相关, 并且在抗PD-1治疗过程中动态变化。在治疗早期, ePD-L1升高幅度可作为肿瘤细胞对T细胞再激活的适应性反应指标, 可依据该指标将临床应答者与无应答者分层。在肺癌和乳腺癌细胞外泌体也可检测到PD-L1的表达[15]。此外, 有研究证明, 在黑色素瘤和肺癌中, 疾病完全/部分缓解的患者治疗前后平均外泌体PD-L1 mRNA水平明显下降[（830.4± 231.3）拷贝数/mL vs. （242.5± 82.5）拷贝数/mL, P=0.016][17]。但该研究中接受免疫治疗的总人数仅18人, 其中肺癌8人。PD-L1 mRNA表达受多方面因素调控, 其能否真正反应个体PD-L1表达水平有待进一步验证。目前尚未见NSCLC中有关ePD-L1与原细胞PD-L1表达水平或免疫治疗预后相关的报道。

本研究与既往研究虽然在方法和思路上有所不同, 但都同样证明了ePD-L1检测的可行性并探讨了其与肿瘤细胞PD-L1表达水平的关系。在临床实践中, 当患者肿瘤组织可及性较差时, 血浆ePD-L1检测或可作为肿瘤组织PD-L1表达水平的初筛。在ePD-L1表达呈阳性时, 可反映肿瘤组织PD-L1表达水平; 反之, 在ePD-L1检测呈阴性时, 应以肿瘤组织PD-L1的检测结果为准。本研究与既往研究不同之处在于：第一, 直接检测ePD-L1蛋白而不是外泌体PD-L1 mRNA, 更真实地反映ePD-L1表达水平; 第二, 在NSCLC的细胞系上证实了ePD-L1水平受肿瘤组织本身PD-L1表达水平和其外泌体释放量的双重影响, 为以后ePD-L1检测结果的解读奠定基础。

本研究存在以下局限性：首先, 本研究只是基于细胞系的研究, 在将来的研究中需要使用NSCLC患者外周血进行这一结果的验证; 其次, Western Blot方法属半定量检测技术, 难以将ePD-L1水平量化。

综上, 本研究验证了NSCLC中ePD-L1检测的可行性, 证明了PD-L1表达阳性的细胞系可释放携带PD-L1的外泌体。但由于其含量受细胞本身PD-L1表达水平和外泌体释放含量的双重影响, 对ePD-L1检测结果应谨慎解读。在ePD-L1表达呈阳性时, 可反映肿瘤组织PD-L1的表达水平; 反之, 当ePD-L1检测呈阴性时, 应以肿瘤组织PD-L1表达水平为准。在未来, 我们可以采用灵敏度更高且可量化的蛋白质检测技术, 如蛋白质质谱技术等来检测NSCLC患者血浆ePD-L1。

The authors have declared that no competing interests exist.

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