Twist基因于1987年被发现存在于果蝇体内, 之后陆续在非洲蟾蜍、文昌鱼、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类中被发现^[4]。Twist基因在脊柱动物中具有高度同源性。人Twist基因位于7p21.2, 包含2个外显子和1个内含子。第1个外显子包含整个编码区域, 长度为772 bp, 第2个外显子为5’ 端非翻译外显子, 内含子长度为536 bp。Twist转录产生的mRNA全长1 669 bp, 包含一个由609个碱基构成的连续开放性读码框（+315~+922）^[5]。Twist包括Twist1（Twist）和Twist2（dermo-1）两种基因^[6]。Twist1和Twist2的碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）结构和羧基端的功能域有超过90%是一致的。Twist1的N-端富含甘氨酸, 而Twist2的N-端则缺少甘氨酸。

人Twist蛋白由202个氨基酸构成, 分子量26 kD, 等电点9.591, 由N-端、bHLH、C-端三个区域组成。其C-端呈疏水性, N-端为亲水性^[8]。Twist蛋白为bHLH转录因子, 其特点为有一个保守结构域内两个相邻且可以舒展的两性碱基氨基酸按照α -螺旋构成一个跨螺旋环。Twist蛋白通过α -螺旋与第二个bHLH结构因子结合, 形成一个二聚体, 结合到CATATG核苷酸序列上, 此结构被称为NDE1E盒（nuclear distribution gene E homolog 1 E-box）^[7]。bHLH转录因子是调节细胞生长分化的重要因子之一, 主要通过参与调控器官生长发育、细胞增殖分化、肿瘤发生发挥生物学效应^[9]。

正常生理情况下, Twist主要表达于胎盘、中胚层及中胚层衍生的组织中（如肌肉、脂肪组织、骨髓等）。Twist主要通过促进上皮-间质转化作用（epithelial-mesenchymal transition, EMT）对胚胎发育起重要作用。人类Twist基因缺失或者突变会导致Saethre-Chotzen综合征（真性尖头畸形伴手或足并指/趾畸形）, 这是一种常染色体显性遗传病, 主要表现为短头畸形、面部不对称、眼睑下垂、眶距增宽、鼻纵隔偏曲、面部凹陷、小耳、错颌、并指等发育缺陷症状^[10]。

Twist基因突变主要发生于人类上皮细胞来源的肿瘤, 且与肿瘤的发生发展密切相关。Twist是一类凋亡抑制蛋白, 能够直接作用于p53的启动子区域, 并负向调控p53的启动子区域, 抑制基因的表达。同时, Twist也能够通过抑制辅助转录因子p300介导的乙酰化作用, 间接抑制p53的表达。此外, Twist可以通过与同源盒蛋白（homeobox protein A5, HOXA5）结合, 共同调节p53上游调控因子ARF的表达, 阻止p53翻译后的修饰, 导致p53失活, 促进肿瘤细胞的增长^{[11, 12]}。

在胃癌中, Twist通过诱导miR-10b促进AKT（又称蛋白激酶B, protein kinases B, PKB）磷酸化, 并激活PI3K/AKT信号转导途径, 促进肿瘤细胞抗凋亡的能力^[13]。Kim等^[14]也发现在膀胱癌中, 骨膜蛋白（periostin, POSTN）能够通过Twist调节AKT信号通路, 促进肿瘤细胞的侵袭。信号传导与转录激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）与Twist也有密切的联系, Zhang等^[15]的研究显示, 活化的STAT3信号可能与Twist、E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达相关, 并介导肝癌的浸润和发展。

Terauchi等^[16]发现, 卵巢癌HEY SKOV-3细胞系Twist高表达, 用siRNA沉默Twist的表达后, 肿瘤细胞由纤维运动型转变为上皮型, 出现间质-上皮转变（mesenchymal-epithelial transition, MET）, 并且出现CD29、CD44等黏附因子, 证实Twsit可以调控卵巢癌的侵袭和转移。

以上研究表明, Twist在肿瘤的发生发展中起了极其重要的调控作用。

EMT是1982年由Greenberg和Hay提出的, 指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程^[17]。其主要表现为细胞黏附分子（如E-cadherin）表达的减少、细胞角蛋白（cytokeratin）为主的细胞骨架转化为波形蛋白（vimentin）为主的细胞骨架, 以及形态上具有间质细胞的特征等。根据EMT发生的特定生物学环境将其分为3种亚型：1型EMT参与胚胎及组织器官发育; 2型EMT参与创伤修复和组织纤维化; 3型EMT参与恶性肿瘤的侵袭和转移。EMT相关基因, 如Twist基因、Snail基因、Slug基因、Sip1基因等主要通过特异性识别靶基因启动子上的E-box基序的DNA结合序列诱导EMT。因此当恶性肿瘤中出现EMT时, 可以认为是肿瘤浸润的开始。众多研究表明Twist1促进乳腺癌的转移与EMT的表达密切相关^{[18, 19]}。Yang等^[20]进行的小鼠乳腺癌细胞株体内外的系列实验表明： Twist的高表达与肿瘤转移呈明显相关性; 抑制Twist的表达可以降低乳腺癌肺转移结节的数量和生长速率; Twist通过与E-cadherin启动子序列上的E-box结合, 导致E-cadherin介导的细胞间黏附作用降低, 从而增加肿瘤的侵袭能力。因此作者认为Twist可以通过活化EMT, 促进肿瘤的转移。

Twist能直接抑制E-cadherin表达, 同时上调vimentin和N-cadherin。此外, Twist也能够诱导snail1和snail2表达, 从而诱导EMT发生^[21]。Wu等^[22]发现醛酮还原酶家族1成员B1（aldo-keto reductase 1 member B1, AKR1B1）可以促进PGF2转化为PGF2_α , 并激活NF-κ B信号通路, 促进基底样乳腺癌（basal-like breast cancer, BLBC）的发生和转移, 而Twist2能够通过促进诱导AKR1B1的表达促进这一过程。

Ma等^[23]发现Twist可以诱导miR-10b的表达, 使其直接结合MIRN10B, 从而导致转移基因RhoC的表达, 促进乳腺癌的侵袭与转移。Drasin等^[24]也发现miR-424在Twist1介导的EMT过程的早期会上调, miR-424的升高可以增加乳腺癌细胞的运动性, 降低黏附性, 而降低miR-424的表达则可以逆转EMT, 且这一过程受到MAPK-ERK信号通路调控。Li等^[25]发现乳腺癌中miR-720的表达降低, 而既往研究发现miR-720可以抑制Twist1的表达从而阻止乳腺癌的发展。Nairismä gi等^[26]也发现miR-33b可以调节Twist1的表达, 抑制乳腺癌的侵袭和迁移。

叉头盒蛋白A1（forkhead box protein A1, FOXA1）是正常乳腺上皮细胞中表达的转录因子, 主要作用是维持导管形态和上皮分化。大量研究表明FOXA1的表达与乳腺癌的分子分型和恶性程度呈高度相关性^{[27, 28]}。Xu等^[29]发现, Twist1可以通过募集NuRD复合物到FOXA1的启动子上, 导致H3K9脱乙酰化, 并使FOXA1的表达沉默。因此作者认为Twist1沉默FOXA1的过程是乳腺癌侵袭和转移的必要条件。

WNT蛋白作为一类被脂肪酸修饰的分泌型蛋白可以与细胞膜上的穿膜卷曲蛋白受体结合, 激活细胞内不同的信号通路^[30]。WNT蛋白的功能失调或异常激活均可导致乳腺癌的发生发展。Shi等^[31]的研究发现, 溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4, BRD4）能够被乙酰化的Twist征募到WNT5A的启动子上增强其表达, 从而有利于侵袭以及干细胞样细胞的形成。同时还表明可能存在抑制Twist1乙酰化的机制, 从而阻止Twist1的活化。该研究同时还证实破坏Twist1与BRD4的相互作用可以抑制Twist1介导的基因转录激活, 同时也会抑制BLBC的致瘤性。此外还有研究发现WNT信号通过LRP6在基底样乳腺癌细胞中可以诱导Twist和Slug的产生, 从而诱导EMT的发生。该研究还通过DDK1的异位表达从而使LRP6受体失活, 影响WNT信号转导, 从而降低肿瘤的成瘤性。

Lee等^[32]发现在乳腺癌中泛素连接酶8（RING finger protein 8, RNF8）高表达, RNF8可以介导K63连接的Twist泛素化, 促进其稳定性, 这一过程主要发生在细胞核中, 以调控EMT过程以及肿瘤干细胞的功能。研究者也证实RNF8在三阴性乳腺癌细胞系中被消耗后, 会导致其在微球体中的生长能力降低, 而在泛素化缺陷型Twist突变体中, 这一现象会消失。此外, 研究者还证明了RNF8被消耗后, 肿瘤干细胞对于化疗的敏感性会升高, 在对临床样本分析中发现晚期耐药患者RNF8的表达水平升高。

Cheng等^[33]发现STAT3能够通过与人Twist1基因启动子近端的结合位点特异性结合并活化Twist1基因的转录。研究证实了抑制STAT3的活性能降低 Twist1表达, 导致乳腺癌细胞的侵袭及转移能力下降, 且这一过程与STAT3 Tyr（705）磷酸化有很强的相关性。而Lo等^[34]也报道了乳腺癌中, EGF/EGFR信号传导途径能够通过STAT3介导Twist基因表达并诱导癌细胞发生EMT。

Twist与乳腺癌的耐药也有密切关系。化疗是癌症治疗的重要方式之一, 如果调高化疗敏感的肿瘤细胞EMT相关基因的表达, 可以使肿瘤细胞发生EMT的同时降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。有研究发现将高表达Twist和p53-MDM2的MCF-7细胞系经多柔比星处理后, 发生EMT, 对多柔比星产生耐药并增强了细胞侵袭性; 而将发生EMT的MCF-7细胞系的Twist基因敲除后, 可以逆转细胞的耐药性并提高对多柔比星的反应性^[35]。还有研究发现谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase, TG）基因转染乳腺癌细胞, 会导致EMT的发生, 同时细胞对多柔比星的敏感性会降低, 这种改变与Twist1的过表达有关系。Cheng等^[36]发现Twist可以直接作用于Akt2的E-box启动子区域, 上调Akt2的表达, 抑制细胞凋亡, 且癌细胞的侵袭能力和对紫杉醇的耐药能力会上升。

内分泌治疗对于激素受体（hormone receptor, HR）阳性的乳腺癌患者是最有效的治疗方式之一。有研究发现在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中, Twist可以调节雌激素受体, 并使雌激素受体功能丧失, 从而导致激素受体耐药性的产生, 即表现为内分泌治疗耐药。研究还发现, Twist能够与组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1, HDAC1）共同作用于雌激素受体启动子区域, 进一步降低雌激素受体的表达。因此作者认为Twist可能是一个内分泌耐药靶点^{[37, 38]}。

乳腺癌的成瘤过程依赖于血管的生成, 新生血管则是乳腺癌快速生长的结构和形态学基础^[39], 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）作为血管内皮特异性的肝素结合生长因子, 能够增加血管通透性, 促进血管内皮细胞的生长和增殖以及血管形成。VEGF通过旁分泌的形式作用于血管内皮细胞受体, 经过酪氨酸酶传导通路发挥功效。

Mironchik等^[40]研究发现在乳腺癌MCF-7细胞系中过表达Twist后, VEGF的表达增高, 将Twist阳性的MCF-7细胞接种到免疫缺陷小鼠体内, 会导致瘤内血管容量增加, 血管通透性上升, 且成瘤大小相对于对照组明显增加。Hu等^[41]也发现在乳腺癌MCF-7细胞系中, 凝血酶可以通过调节Twist1的表达来调控VEGF、激酶插入受体（kinase insert domain receptor, KDR）等多种血管生长因子和受体的表达。作者认为凝血酶上调Twist是导致内皮细胞迁移、Martigel小管形成和凝血酶诱导肿瘤血管生成所必须的途径。

Marchelli等^[42]在人正常的乳腺上皮细胞HMLE细胞系中转染Twist1并不能有效增加VEGF的分泌, 但是巨噬细胞趋化因子配体2（chemokine ligand 2, CCL2）的表达却明显上升。研究者发现在敲低乳腺癌细胞的Twist1表达水平后, 阻断了巨噬细胞的募集和肿瘤血管生成。而导入外源性CCL2后, 癌细胞又重新获得了吸引巨噬细胞和促进血管生成的能力。作者认为Twist1可促进CCL2的转录, 导致CCL2蛋白增加, 并吸引巨噬细胞聚集, 促进血管生成。Alaoui等^[43]发现Kindlin-3蛋白能与整合素β 1通过发生协同作用, 增加Twist1的表达并促进VEGF的分泌, 最终促进血管生成。此外, 作者还发现乳腺癌细胞中Twist1的过表达依赖于Kindlin-3表达水平的增高, 这一现象跟乳腺癌细胞对于多柔比星和紫杉醇的耐药相关。

Al-Hajj等^[44]发现CD44⁺/CD24^-/low表型的乳腺癌细胞可以作为乳腺肿瘤干细胞（breast cancer stem cell, BCSC）, 相较于其它表型的乳腺癌细胞, 该表型的乳腺癌细胞具有更强的多向分化成瘤和自我更新的能力, 是恶性肿瘤复发转移的基础, 并在细胞成瘤实验中具有很强的成瘤能力和侵袭转移能力。Mani等^[45]发现在乳腺上皮细胞中, 通过过表达Twist1诱导EMT后, CD44⁺/CD24^-/low干细胞数量显著增加, 而分离出的乳腺上皮细胞则表达Twist1、Slug、Snail等EMT相关诱导因子。Odoux等^[46]发现, 静止的CD44⁺/CD24^-/low乳腺癌干细胞经过EMT转化后会成为有迁移能力的肿瘤干细胞, 从而使肿瘤扩散。这类细胞表现出明显的E-cadherin表达降低、vimentin和N-cadherin表达升高以及其他EMT相关转录因子的表达增高。

有研究称青蒿素酯（artemin, ARTN）在雌激素受体阴性的乳腺癌中可以通过Twist1诱发EMT。在此基础上, Banerjee等^[47]研究发现在激素受体阴性的乳腺癌细胞系中, ARTN被消耗会使癌细胞恢复对电离辐射和紫杉醇的敏感性。通过研究ARTN对BCSC的影响, 研究者发现ARTN主要通过增强Twist1-BCL-2依赖性的肿瘤干细胞促进乳腺癌细胞的耐药性。

Liang等^[48]研究发现异黏蛋白（metadherin, MTDH）可以介导激活组蛋白H3乙酰化, 并结合到Twist1启动子区域, 间接介导了肿瘤干细胞的富集。研究者还发现MTDH可以通过结合组蛋白乙酰转移酶CBP, 阻止其自身泛素化降解, 从而调节Twist1的转录。作者通过对临床标本的分析发现, MTDH的表达与Twist1和肿瘤干细胞表达呈正相关, 揭露了MTDH是可能存在调控乳腺致瘤性的潜在靶点。

还有研究者通过生物信息学对多个IncRNA相关的信号转导途径进行了分析鉴定发现, 由Twist转录调控的Shh-GLI1途径相关的IncRNA-Hh直接靶向GAS1以刺激Hh（hedgehog signaling）信号激活。活化的Hh可以增高GLI1的表达, 并且增高SOX2和OCT4的表达, 并在肿瘤干细胞中起调节作用。作者通过在Twist阳性乳腺癌细胞中沉默IncRNA-Hh的表达以及降低肿瘤干细胞相关的SOX2和OCT4水平, 发现可以降低移植肿瘤的球囊形成效率以及转移肿瘤的发生^[49]。

Twist广泛参与到乳腺癌的发生、发展、转移等过程当中, 随着对其机制研究的深入, 如果可以靶向沉默Twist的表达, 将为治疗乳腺癌带来新的方向。