引用本文
钟巧囡, 林喜娜, 奚少彦, 何新明, 林晓东, 顾霞. 甲状腺乳头状癌中BRAFV600E突变蛋白表达的意义 . 循证医学, 2019,19(6): 349-352.
ZHONG Qiao-nan, LIN Xi-na, XI Shao-yan, HE Xin-ming, LIN Xiao-dong, GU Xia. Clinical Significance of BRAFV600E Mutation in Papillary Thyroid Carcinoma[J]. Journal of Evidence-Based Medicine,2019,19(6): 349-352.  
DOI:10.12019/j.issn.1671-5144.2019.06.008
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甲状腺乳头状癌中BRAFV600E突变蛋白表达的意义
钟巧囡1, 林喜娜1, 奚少彦2, 何新明1, 林晓东1, 顾霞1
1. 广州医科大学附属第一医院病理科, 广州 510120
2. 中山大学附属肿瘤医院病理科, 广州 510060
通讯作者: 顾霞, Tel：020-83062547; E-mail：guxia1373@163.com
作者简介:

钟巧囡（1985-）,女,广州人,硕士研究生,研究方向为肿瘤病理学。

基金项目:广东省医学科学技术研究基金资助项目（20181030153136778）
摘要

目的 探讨甲状腺乳头状癌中BRAFV600E突变蛋白的表达情况,分析其与临床病理特征的关系。方法 应用免疫组织化学检测244例手术切除甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织的BRAFV600E突变蛋白表达情况,结合临床病理学资料,分析BRAFV600E突变与临床病理参数之间的关系。结果 BRAFV600E突变蛋白仅在甲状腺乳头状癌组织中表达,表达率为86.48%,癌旁非肿瘤组织不表达;经典型乳头状癌的突变阳性率为88.89%,高于滤泡型的78.18%（ χ2=4.176, P=0.041）;有淋巴结转移患者（85%）的突变率高于无转移患者（68.42%）（ χ2=4.526, P=0.033）;有被膜侵犯患者（94.64%）的突变率高于无被膜侵犯者（84.04%）（ χ2=4.145, P=0.042）;差异均有统计学意义。而与不同肿瘤直径、年龄、性别和病灶数量之间的差异均无统计学意义（ P>0.05）。结论 BRAFV600E突变蛋白在甲状腺乳头状癌中呈高表达,其表达与淋巴结转移和被膜侵犯有显著相关,提示BRAFV600E突变可能与肿瘤侵袭性相关,可作为甲状腺乳头状癌预后的预测因子。

关键词: 甲状腺乳头状癌; BRAFV600E突变蛋白; 免疫组化
中图分类号:R736.1 文献标识码:A 收稿日期: 2019-08-26
Clinical Significance of BRAFV600E Mutation in Papillary Thyroid Carcinoma
ZHONG Qiao-nan1, LIN Xi-na1, XI Shao-yan2, HE Xin-ming1, LIN Xiao-dong1, GU Xia1
1. Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China
2. Department of Pathology, Sun Yat-sen University Cancer Center, Guangzhou 510060, China
Abstract

Objective To investigate the expression of BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma and analyze its relationship with clinicopathological features.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of BRAFV600E mutant protein in 244 patients with papillary thyroid carcinoma and adjacent tissues. The relationship between BRAFV600E mutation and clinicopathological parameters was analyzed with clinical pathological data.Results BRAFV600E mutant protein was expressed only in papillary thyroid carcinoma, and the expression rate was 86.48%. The non-tumor tissue adjacent to the tumor was not expressed. The expression rate was 88.89% in classic papillary thyroid carcinoma, 85% in lymph node metastasis group, and 94.64% in capsule invasion group, which were higher than follicular type（78.18%）（ χ2=4.176, P=0.041）, non-lymph node metastasis group （68.42%）（ χ2=4.526, P=0.033） and non-capsule invasion group （84.04%）（ χ2=4.145, P=0.042）, respectively, and corresponding comparison have significant statistical difference（ P<0.05）. There were no significant differences between the different tumor diameters, ages, genders and lesions number（ P>0.05）.Conclusion BRAFV600E mutant protein is highly expressed in papillary thyroid carcinoma, and its expression is significantly associated with lymph node metastasis and capsular invasion. It suggests that BRAFV600E mutation may be associated with tumor invasion and may be a predictor of papillary thyroid carcinoma prognosis.

Key words: papillary thyroid carcinoma; BRAFV600E mutation protein; immunohistochemistry

甲状腺癌是内分泌系统和头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤, 近年来发病率逐渐增长[1]。甲状腺癌常见类型包括乳头状癌、滤泡癌、髓样癌和未分化癌, 临床上以甲状腺乳头状癌最为常见, 约占90%以上[2]。甲状腺乳头状癌的生物学行为大多较温和, 预后较好, 但仍有少部分患者因复发和远处转移而导致死亡。许多研究表明, BRAFV600E突变是甲状腺乳头状癌最常见的突变类型, 与甲状腺癌的进展相关[3]。迄今, BRAFV600E突变与甲状腺乳头状癌病理参数之间的关系尚不完全明确, 本研究应用免疫组化方法检测甲状腺乳头状癌中BRAFV600E突变蛋白的表达情况, 探讨其与甲状腺乳头状癌临床病理特点的关系, 以期为甲状腺乳头状癌的预后预测提供依据。

1 材料与方法
1.1 研究对象

收集2015年1月1日至2019年7月31日在广州医科大学附属第一医院甲状腺癌手术切除标本 244例, 所有病例均做免疫组化CK19、Galectin-3和TPO明确诊断。其中男性59例, 女性185例, 年龄16~82岁[平均（42.62± 13.87）岁]; 肿瘤直径0.05~7 cm[平均（1.46± 1.01）cm]。其中经典型乳头状癌189例、滤泡型乳头状癌55例; 另选取癌旁组织40例作为对照组。所有病理切片经两名高年资病理医生按照WHO内分泌肿瘤分类（2017版）中甲状腺肿瘤的分类标准重新阅片[4]。

1.2 主要试剂

BRAF（V600E）鼠抗人即用型单克隆抗体（克隆号VE1）为罗氏诊断试剂, 二抗采用罗氏诊断Envision检测系统试剂盒。

1.3 免疫组化染色

组织标本用10%中性缓冲福尔马林固定, 梯度酒精脱水、浸蜡、石蜡包埋, 4 μ m层厚组织切片, 常规脱蜡, 应用罗氏BenchMark Ultra全自动免疫组织化学染色仪进行染色, 苏木精复染, 冲洗后梯度酒精脱水、二甲苯透明, 中性树胶封片。用结肠癌阳性病例作为阳性对照, 磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4 判定标准

BRAFV600E突变蛋白阳性产物均定位于细胞质, 以细胞质中出现棕黄色颗粒状物为阳性。高倍镜（× 400）下对每张切片随机选10个视野计算阳性细胞百分率, 阳性细胞数> 5%为阳性（+）, 未着色或阳性细胞数< 5%为阴性（-）[5]。

1.5 统计学分析

所有临床病理信息均采用Excel 2007表格进行处理, 对汇总数据采用SPSS 22.0进行统计学分析; 计数资料采用频率和百分比表示, 计量资料采用均数 ± 标准差进行统计描述; 组间比较采用卡方检验、Fisher确切概率和t检验, P≤ 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 BRAFV600E突变蛋白在甲状腺乳头状癌及癌旁组织中的表达

BRAFV600E突变蛋白仅在肿瘤细胞中表达, 阳性率为86.48%（211/244）, 所有病例皆为弥漫强阳性表达（++~+++）, 而癌旁组织全部为阴性。见图1和图2。

图1 经典型甲状腺乳头状癌的病理图像
A：HE染色, × 100; B： BRAFV600E突变蛋白在经典型甲状腺乳头状癌肿瘤细胞呈阳性表达, 癌旁非肿瘤组织不表达, 免疫组化染色, × 100

图2 滤泡型甲状腺乳头状癌的病理图像
A：HE染色, × 100; B： BRAFV600E突变蛋白在甲状腺滤泡型乳头状癌肿瘤细胞呈阳性表达, 癌旁非肿瘤组织不表达, 免疫组化染色, × 100

2.2 甲状腺乳头状癌BRAFV600E突变蛋白的表达与临床参数的关系

BRAFV600E突变蛋白阳性者年龄均数[（43.49± 13.76）岁]大于阴性者[（37.09± 13.46）岁], 差异有统计学意义（t=2.49, P=0.013）; 肿瘤直径均数[（1.44± 1.01）cm]略小于阴性者[（1.54± 1.02）cm], 差异无统计学意义（t=0.535, P=0.593）。甲状腺乳头状癌患者以女性多见, 占总人数的75.8%。男性BRAFV600E突变蛋白阳性率为93.22%（55/59）, 稍高于女性的84.32%（156/185）, 两者差异无统计学意义（χ 2=3.027, P=0.082）; 年龄> 45岁者BRAFV600E突变蛋白表达为91.18%（93/102）, 略高于≤ 45岁者的83.0%（118/142）, 差异无统计学意义（χ 2=3.312, P=0.069）。组织学类型, 经典型乳头状癌BRAFV600E突变蛋白阳性率为88.89%（168/189）, 高于滤泡型的78.18%（43/55）, 差异有统计学意义（χ 2=4.176, P=0.041）。有淋巴结转移患者[85%（51/60）]的BRAFV600E突变蛋白表达率高于无转移患者[68.42%（39/57）]（χ 2=4.526, P=0.033）; 有被膜侵犯患者[94.64%（53/56）]的BRAFV600E突变蛋白表达率高于无被膜侵犯者[84.04%（158/188）]（χ 2=4.145, P=0.042）, 差异均有统计学意义。而BRAFV600E突变蛋白表达与肿瘤大小、病灶的多发性及血管侵犯的组间差异无统计学意义, 见表1。

表1 BRAFV600E突变蛋白与临床病理参数的关系
3 讨 论

BRAF是一种原癌基因, 又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1, 是RAF蛋白激酶家族中的一员, 位于7号染色体上, 在Ras-Raf-MEK-ERK信号转导中起重要作用, 参与调控细胞的生长、分化及凋亡; 2003年, 有学者在甲状腺癌中首次发现BRAF突变, 是甲状腺乳头状癌中最常见的遗传学改变, 90%表现为15号外显子的T1799A错义点突变, 导致其编码的BRAFV600E突变蛋白结构异常[6], 应用罗氏诊断的BRAF（V600E）鼠抗人即用型单克隆抗体通过免疫组化可检测BRAFV600E突变蛋白的表达。有学者通过系统回顾、荟萃分析和诊断试验准确性回顾对1 141例甲状腺乳头状癌病例进行研究, 检测BRAFV600E突变蛋白阳性率为79.1%, BRAFV600E突变率为76.6%, 免疫组化阳性组和阴性组的一致性比率分别为92.1%和89.4%; 在诊断试验的准确性评估中, 综合敏感性和特异性分别为97%和78%; 受试者工作特征曲线的曲线下面积值为0.983, 诊断优势比为164.28, 结果表明免疫组化检测BRAFV600E突变蛋白与BRAFV600E基因突变检测具有很强的一致性[7]。这提示该抗体免疫组化检测癌组织中BRAFV600E突变蛋白的测定可以间接替代用PCR法测定BRAFV600E基因突变。

BRAFV600E突变与甲状腺乳头状癌的生物学行为的相关性目前尚无统一结论, 有研究认为BRAFV600E突变是甲状腺乳头状癌淋巴结转移的预测因素[8]; Li等[9]的分析指出BRAFV600E突变与经典型乳头状癌、包膜完整性、淋巴结转移等相关; 本组资料中BRAFV600E突变蛋白的表达率在淋巴结转移组中（85%）高于无淋巴结转移组（68.42%）, 被膜侵犯组中的表达率也明显高于无被膜侵犯组, 差异有统计学意义, 与上述文献结果基本一致, 提示BRAFV600E突变蛋白阳性的乳头状癌有更高的侵袭性生长趋势, 有较高的浸润和转移能力。有研究[10]指出甲状腺乳头状癌亚型中BRAFV600E突变率从高至低依次为高细胞亚型、经典型和滤泡型（56%、53%和31%）, BRAFV600E基因突变与组织亚型密切相关。本组研究显示经典型甲状腺乳头状癌的BRAFV600E突变蛋白表达率明显高于滤泡型, 与上述文献结果一致。

关于BRAFV600E突变蛋白的表达与性别、年龄的关系, 本研究显示, 与男性相比, 尽管女性有较高的发病率, 但男性患者的BRAFV600E突变率（93.22%）更高, 高于女性的84.32%, 年龄> 45岁者BRAFV600E突变蛋白表达为91.18%, 略高于≤ 45岁者的83.1%, 但性别与年龄的组间差异无统计学意义。Li等[9]的研究结果显示BRAFV600E突变蛋白表达在男性和高年龄组（> 45岁）高于女性和低年龄组（≤ 45岁）, 差异有统计学意义; 而杨敬和颜康康等[10, 11]研究中国人的结果也显示BRAFV600E突变蛋白表达与性别、年龄无关, 与我们的结果一致, 存在这些差异可能与不同种族、样本的差异和不同克隆的抗体等因素有关。

杨敬等[10]及Li等[9]研究也指出BRAFV600E突变与肿瘤直径大小、病灶数目无关, 我们的结果与其一致。关于血管侵犯与BRAFV600E突变关系的文献较少, 有报道[12]指出BRAFV600E突变与血管侵犯无相关性, 本组资料也未发现两者的相关性, 这可能是由于甲状腺乳头状癌主要通过淋巴转移, 血管侵犯较少见, 且本研究中多数为早期患者。本研究未能证明BRAFV600E突变与肿瘤直径大小相关, 这可能提示微小癌同样具有恶性侵袭倾向, 即使肿瘤直径在临床上作为TNM分期的首要根据, 但仍然不能忽视微小癌患者的术后管理。

综上所述, 甲状腺乳头状癌中BRAFV600E突变蛋白表达与淋巴结转移、被膜侵犯和经典型等临床病理特征相关, 与甲状腺乳头状癌的侵袭性相吻合, 提示BRAFV600E突变蛋白阳性可以作为甲状腺癌患者预后的预测因子, 为复发危险分层提供参考依据。

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