目前, 两种CD19靶向CAR-T细胞疗法已获得美国FDA批准可用于复发/难治性淋巴瘤的治疗。Axicabtagene-Ciloleucel（Axi-cel）是以CD28作为共刺激结构域的二代抗CD19 CAR-T细胞产品, 用于经二线及以上系统治疗失败的难治/复发性B细胞淋巴瘤, 包括DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（primary mediastinal large B cell lymphoma, PMBCL）, 源于滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma, FL）的DLBCL（即转化型FL, tFL）和高级别B细胞淋巴瘤。108例接受Axi-cel治疗的Ⅰ 期+Ⅱ 期研究中, 总体反应率（overall response rate, ORR）为83%, 完全缓解率（complete remission, CR）为58%, 3级或更高级别的细胞因子释放（cytokine release syndrome, CRS）和神经毒性分别为11%和32%, 反应中位持续时间为11个月, 未达到中位总体生存期, 中位无进展生存期为5.9个月, 随访2年的数据表明, Axi-cel治疗反应持久, 中位总生存期超过2年, 并且对于DLBCL患者长期安全性可控^[1]。2018年5月, 第二个治疗复发或难治性淋巴瘤的CAR-T药物Tisagenlecleucel被FDA批准, Tisangelecleucel也是二代抗CD19 CAR-T细胞, 不同的是, 使用4-1BB作为共刺激域, 以慢病毒作为载体, 适应证不包括PMBCL。Tisagenlecleucel治疗复发/难治性DLBCL的国际多中心Ⅱ 期临床研究中, 93例可评估的患者, CR为40%, 部分缓解率（partial response, PR）为12%, 1年无复发存活率（relapse-free survival, RFS）为65%, ≥ 3级CRS和神经毒性的比例分别为22%和12%^[2]。而第三个治疗NHL的CAR-T产品Lisocabtagene Maraleucel （JCAR017）目前正在研究中, ORR和CR率分别为74%和52%, 值得注意的是, 该试验中患者反应率与高危DLBCL的特征不相关, 如双打击淋巴瘤、化疗耐药或先前自体移植失败。这三种产品的CRS发生情况相似, 即绝大部分患者出现1~2级CRS, 而严重的神经毒性, Tisagenlecleucel-T和Lisocabtagene Maraleucel治疗后发生率较低^[3]。最初的临床试验中, 排除了那些累及中枢神经系统、合并艾滋病病毒和活动性乙型肝炎病毒的淋巴瘤患者, 最近研究结果显示靶向CD19的CAR-T疗法治疗此类患者也具有良好疗效和安全性^{[4, 5, 6]}。

尽管靶向CD19的CAR-T细胞治疗在复发/难治淋巴瘤患者获得了较高的反应率, 但仍有至少超过一半的患者最终出现复发或疾病进展, 部分患者可能是CD19抗原丢失导致的免疫逃逸, 但也存在CD19抗原阳性的复发, 因此研究复发的机制和提高CAR-T细胞疗效的方法、寻找新的治疗靶标将有助于改善患者疗效。CAR-T治疗后复发患者可考虑:①设计更有效的CAR-T细胞, 如第三代或者第四代CAR; ②辅助疗法联合CAR-T治疗, 能够改善T细胞功能的药物, 例如依鲁替尼、来那度胺、免疫检查点抑制剂、IL-2或IL-12等, 可以成功地与CAR-T细胞疗法联合使用, 以提高其疗效^{[7, 8]}; ③设计靶向CD19和CD20或CD22等的双特异性CAR-T细胞以及多特异性CAR-T细胞以同时靶向多种肿瘤抗原, 可最大程度地降低免疫逃脱^{[9, 10]}。

总之, CAR-T细胞疗法是复发难治NHL患者当今最有前途的疗法之一, 靶向CD19的CAR-T细胞是对两种疗法均无效DLBCL患者新的标准疗法。但CAR-T治疗仍存在诸多挑战和无法回答的问题需进一步研究。

FDA批准的靶向CD19的CAR-T细胞产品Tisagenlecleucel, 其另一适应证是复发/难治B-ALL。Ⅱ 期国际多中心临床研究中, 75例接受治疗的患者, ORR为81%, CR为60%, 完全缓解患者的12个月RFS为59%^[11]。靶向CD19 的CAR-T细胞在复发/难治B-ALL患者临床疗效良好, 副反应可控, 而CAR-T治疗前接受大剂量化疗和残留病水平较低的患者疗效更好^[12], 基线血小板计数、乳酸脱氢酶和淋巴结清除方案均可影响治疗后微小残留病（minimal residual disease, MRD）阴性CR患者的无事件生存（event-free survival, EFS）^[13]。但是仍有小部分患者对治疗无反应, 还有相当一部分患者（43%~55%）1年内复发, 这类患者预后不良。抗原丢失、突变或表达降低是对CD19靶向免疫疗法产生耐药性或复发的常见原因, CD22也在大多数B-ALL中表达, 通常在CD19丢失后仍保留。国内童春容教授等对CD19 CAR-T细胞治疗失败的34例复发/难治儿童和成年B-ALL患者, 采用CD22 CAR-T细胞治疗, 输注后1个月, 30例可评估的患者, CR或细胞计数不完全恢复的CR分别为80.0%和70.5%, 提示CD22 CAR-T细胞可有效诱导复发/难治 B-ALL患者缓解, 也为后续移植实现持久缓解提供了宝贵的窗口^[14]。2019年ASH会议报道了CD19和CD22双特异性CAR-T治疗复发/难治性B-ALL患者的Ⅰ 期临床试验, 结果显示CD19和CD22双重CAR-T在治疗CD19 + CD22 +复发/难治性B-ALL患者中的安全性、技术可行性、低毒性和剂量依赖性高CR^{[15, 16]}。但与CD19 CAR-T产品相比, 需要更长时间的观察和更多患者来评估CD19 /CD22双重CAR-T的优势。

MM的治疗仍然非常困难, 复发/难治（relapsed/refractory）MM患者的预后差。CAR-T细胞疗法被认为是最有前途的治疗方法之一, 但目前尚未批准针对MM的CAR-T细胞疗法, 诸如B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen, BCMA）、CD38和CD138之类的CAR正在临床试验中进行研究。在大多数MM患者中, BCMA在MM细胞中特异性表达, 在造血干细胞和祖细胞以及非造血重要器官中不表达。最近已经证明BCMA是抗MM的CAR-T细胞中最有前途的抗原^{[17, 18, 19, 20, 21]}。针对BCMA的CAR-T细胞疗法治疗RRMM患者的几个临床试验中ORR为64%~100%, 很好的部分缓解（very good partial remission, VGPR）或CR为36.0%~88.2%, 治疗反应部分缓解以上的患者MRD检测阴性, 严重CRS和神经毒性的发生率与CD19 CAR-T细胞疗法相当^{[17, 18, 19, 20, 21, 22]}。目前的结果表明, BCMA CAR-T细胞疗法有望用于RRMM, 然而, 到目前为止, BCMA CAR-T细胞的长期疗效仍不令人满意, 大多数患者最终会复发, BCMA CAR-T细胞治疗后复发的主要机制是BCMA 低表达MM细胞的逃逸和体内BCMA CAR-T细胞的持久性不足。 因此, 研究人员正在寻找其它靶抗原目标。

最近的研究表明CD19在小部分MM干细胞亚群上表达, CD19还与MM的BM微环境相关的耐药性有关, 因此, CD19也是MM的潜在靶标。初步的研究显示ASCT后RRMM患者, 靶向CD19 CAR-T治疗对某些患者有效, 但需要增加病例数进一步证实^[23]。除此之外, 其他一些CAR-T靶标如:免疫球蛋白κ 轻链、NY-ESO-1、GPRC5D、APRIL和SLAMF7被证明是CAR-T细胞针对MM细胞的良好靶标^{[22, 24, 25, 26]}。

靶向不同抗原的CAR-T细胞可有助于避免因抗原丢失而导致的免疫逃逸。国内研究者采用CD19 CAR-T和BCMA CAR-T序贯疗法治疗MM的临床研究结果显示:ORR为92.6%, 88.9%患者的疗效高于PR, 其中40.7%患者达到CR或严格意义的CR, 毒性可以耐受^[27]。来自华中科技大学附属协和医院的一项研究, 采用BCMA+CD38双靶点CAR-T疗法, 治疗至少经历两种前期疗法的RRMM患者共16例, 中位随访36周时, 未观察到剂量限制性毒性和3级以上的神经毒性, 14例（87.5%）患者获得缓解, 其中8例（50%）获得严格意义的CR、2例（12.5%）获得VGPR、4例（25%）获得部分缓解, 14 例（87.5%）患者达到了MRD阴性; 严格意义CR的最长持续时间超过51周; 中位PFS未达到, 9个月时PFS为75%。值得一提的是, 5个有髓外病变的患者经治疗后, 髓外病灶全部消失。该研究成功入选ASH 2019最佳研究, 这一报道是历史上国内临床方向首个入选的项目, 也是2019年血液肿瘤唯一入选的CAR-T项目^[28]。

临床研究已经证实了CAR-T疗法对MM的疗效, 并且更多的研究者将注意力转向了优化治疗方案, 主要关注预防CAR-T相关的副作用以及提高CAR-T治疗的效率。尚待进一步研究的其他问题包括改善CAR-T细胞的功效和耐用性以及确定CAR-T细胞输注的最佳时机。在MM的CAR-T疗法的未来研究中, 靶标的选择, 结构的改进和联合疗法将是优先考虑的问题。

尽管目前CAR-T疗法在NHL、B-ALL和MM患者获得了良好疗效, 但CAR-T疗法在AML患者的应用却存在诸多困难, CAR-T细胞治疗AML的主要挑战是确定特异性靶标抗原。CAR的理想靶抗原必须是在所有恶性细胞包括肿瘤干细胞上表达, 但在正常细胞不表达或表达很低, 靶抗原也不能表达在激活的T细胞。目前AML患者还没有发现满足这些条件的靶抗原, 因为AML细胞在细胞膜上表达多种干细胞和髓系分化抗原, 例如CD33、CD34、CD123和CD135, 相同的抗原也在正常髓系细胞上表达, 例如CD33在成熟的嗜中性粒细胞, 单核细胞和组织巨噬细胞上也表达, CD123在淋巴祖细胞以及一些分化的淋系和髓系细胞上表达^[29]。

目前几种靶抗原已用于CAR-T治疗AML的临床前研究中, 包括CD174（Lewis-Y抗原）、CD44v6、CLL-1、CD7、叶酸受体β （FRβ ）和CD135（FLT3受体）。表达针对这些分子的CAR-T细胞在体外和体内模型中均显示出有希望的抗白血病活性, 但这些靶分子并非仅表达于白血病原始细胞上, 成熟造血细胞上也可检测到, 例如CD7表达于T细胞上, CLL-1表达于单核细胞上, 在某些情况下, 也会表达于非造血组织, 如CD44v6和CD135分别表达于角质形成细胞和神经元上^{[29, 30, 31]}。因此, 由于CAR-T细胞持续存在而延长的靶向作用/非肿瘤毒性仍是一个需要关注的问题, 可能需要采用终止CAR-T细胞的方法来限制毒性, 这些方法包括自杀基因和对特定细胞基因编辑, 这些基因可以选择性清除CAR-T细胞并通过MoAb介导的CAR-T细胞消除。Borot等^[32]将靶向CD33的CAR-T细胞与造血干细胞移植结合在一起, 该造血干细胞通过基因工程方法消除了表面CD33的表达, 造血干细胞中CD33的缺失不会损害其在体内移植并重新建立功能性多谱系造血系统的能力, CD33去除的造血干细胞与CD33靶向免疫疗法的移植导致白血病清除, 而没有骨髓抑制。CD7表达于大约30%的AML患者白血病原始细胞和恶性祖细胞, 在正常的髓系和红系细胞中不表达, 但却表达于T细胞, Gomes-Silva等^[33]构建了一种CD7基因编辑的（CD7^KO）CD7 CAR-T细胞, 清除白血病细胞的同时, 保留了髓系和红系祖细胞及其子细胞, 提示使用CD7^KO CD7 CAR-T细胞进行CD7⁺ AML的非清髓治疗的可行性。

已发表的CAR-T细胞用于AML患者的临床研究极少, 最近Sun等^[34]报道了1例难治复发FUS-ERG + AML患者, CD123表达阳性, 将供体来源的CAR-T 123作为其单倍体造血干细胞移植预处理方案的一部分, 输注CAR-T 123后2周骨髓原始细胞减少, 并与CAR扩增一致相符, 该患者实现了完全的供体嵌合, 血细胞计数恢复不完全的CR和髓系植入。

根据AML患者肿瘤相关抗原的表达特点, 克服抗原丢失并避免免疫逃逸的方法之一是同时靶向多种抗原, 如靶向CD123和CD33的双CAR, 特异性靶向CLL-1和CD33的CAR-T细胞, 增加一种CAR-T细胞靶向抗原的数量则可以进一步降低抗原的免疫逃逸。此外, 越来越多的证据表明, 抑制性肿瘤微环境也可能有助于AML的免疫逃逸。因此, 用PD-1 / PD-L1阻断剂联合治疗CAR-T细胞治疗可降低免疫逃逸的风险, 包括使用小分子抑制剂和/或检查点抑制剂的联合CAR-T治疗。

总之, CAR-T细胞治疗难治复发血液肿瘤患者获得了不错疗效, 但治疗后复发的机制及治疗对策的研发和选择仍是一个需要研究和探讨的问题。在未来随着基因组编辑和CAR-T细胞设计、构建过程的进步, 以及操纵免疫系统的辅助治疗策略的发展, 有望迎来细胞疗法新时代的到来, 这将为恶性血液肿瘤患者带来更高的治愈率。