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由中国抗癌协会肺癌专业委员会和广东省临床试验协会/中国胸部肿瘤研究协作组主办的“ 第18届中国肺癌高峰论坛” 于2021年3月6日在广州顺利召开。此次论坛以非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）分子残留病灶（molecular residual disease, MRD）为主题, 从肺癌MRD定义、检测以及临床应用三个角度开展相关学术探讨, 并最终达成了专家共识。
MRD在某些情况下也被称为微小残留病灶（minimal residual disease）或可测量残留病灶（measurable residual disease）, 其概念自血液肿瘤逐步延伸至实体肿瘤, 检测对象主要包括有循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）或循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）等。目前在肺癌这一癌种中, MRD研究仍处于前期研究证据的积累当中, 不同研究之间关于MRD的定义及研究方法差别较大, 研究结论之间难以完全互通, 整体上处于“ 摸着石头过河” 的前期探索阶段。因此, 本次肺癌高峰论坛主题与以往有所不同, 重在“ 展望” , 即在肺癌MRD研究热潮即将到来之时, 综合近年来国内外重要研究结果及争议点, 与会专家们进行了详细的讨论和各抒己见的争辩, 旨在为今后的肺癌MRD研究制定规范及主体方向, 并最后达成了以下五点共识。
本共识的共识级别为：
1A级：基于高水平证据（严谨的meta分析或随机对照试验结果）, 专家组有统一认识;
1B级：基于高水平证据（严谨的meta分析或随机对照试验结果）, 专家组有小争议;
2A级：基于低水平证据, 专家组有统一认识;
2B级：基于低水平证据, 专家组无统一认识, 但争议不大;
3级：专家组存在较大争议。
$\bullet$ 肺癌分子残留病变, 指经过治疗后, 传统影像学（包括PET/CT）或实验室方法不能发现, 但通过液体活检发现的癌来源分子异常, 代表着肺癌的持续存在和临床进展可能;
$\bullet$ 肺癌分子异常, 指在外周血可稳定检测出丰度≥ 0.02%的ctDNA, 包括肺癌驱动基因或其他的Ⅰ /Ⅱ 类基因变异
共识级别：2A。
MRD概念最初来自血液系统恶性肿瘤, 如多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病等。在患者经过治疗后, 通过高灵敏度的检测手段, 如流式细胞术、定量聚合酶链式反应、二代测序（next-generation sequencing, NGS）等, 从骨髓或外周血样本中检测出极微量的克隆肿瘤细胞或其来源的分子物质, 以评估患者治疗后体内肿瘤残留状态[1, 2, 3]。MRD状态的评估已成为相关血液肿瘤疾病疗效评价标准之一, 与患者疾病复发、预后分层明显相关[1, 4]。而在实体肿瘤中, MRD与患者术后生存复发之间相关性证据也在不断累积中, 如乳腺癌、结肠癌、肺癌等[5, 6, 7, 8, 9, 10]。在一项前瞻性多中心研究中, 共入组101例带有体细胞突变的早期乳腺癌患者, 通过数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction, dPCR）动态追踪术后血浆ctNDA, 结果提示ctDNA阳性与患者疾病复发明确相关[风险比（hazard ratio, HR）=25.2, 95%可信区间（confidence interval, CI）6.7~95.6, P< 0.001], 且ctDNA较影像学可提前预示疾病复发, 中位10.7个月（95%CI 8.1~19.1个月）[5]。另一项入组130例Ⅰ ~Ⅲ 期结肠癌的多中心队列研究中, 通过多重PCR捕获的NGS监测患者根治性切除术后ctDNA状态, 结果提示术后30天ctDNA阳性患者复发风险远高于阴性患者（HR=7.2, 95%CI 2.7~19.0, P< 0.001）; 若辅助化疗后ctDNA仍为阳性, 其复发风险更是增加17倍之多（HR=17.5, 95%CI 5.4~56.5, P< 0.001）[11]。因此, 在结肠癌美国综合肿瘤网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南中新增了关于ctDNA检测用于评估Ⅰ ~Ⅲ 期患者术后MRD评估的讨论[12]。
对肺癌这一癌种进行MRD检测有其特殊性, 与其他癌种有所区别。首先, 肺癌驱动基因图谱复杂, 其所对应的靶向治疗药物更为多样。近70%的肺腺癌存在至少一个可靶向的驱动基因突变（例如EGFR, ALK, ROS1等）[13, 14, 15], 而其中点突变、插入缺失、融合等不同的突变类型临床意义更是千差万别, 这些复杂的肿瘤突变背景显然对高灵敏度的MRD检测要求更高; 第二, 不同癌种之间ctDNA检出率差别。在一项泛癌种的ctDNA研究中[16], 检出率最高的是小细胞肺癌（91.1%）和前列腺癌（87.9%）, 而NSCLC的ctDNA检出率整体位于中等水平, 变异等位基因频率（variant allelic fractions, VAF）在0.1~0.01之间, 这也提示着不同癌种之间对于ctDNA检测技术要求、MRD阳性阈值必然有所不同; 第三, NSCLC不同基因表型对于ctDNA检出的影响, 如TP53, EGFR突变可显著提高ctDNA检出率[17], 这提示着不同驱动基因、不同的伴随基因突变对于MRD检出同样会带来一定影响。
以上几点均提示肺癌MRD评估与其他癌种之间的区别, 尤其是对于驱动基因阳性与阴性患者之间的差异。基于ADJUVANT、EVIDENCE、ADUAURA等大型Ⅲ 期随机对照临床研究, 国内外指南均推荐对EGFR敏感突变NSCLC患者术后进行辅助靶向治疗[18, 19, 20]。而未来基于MRD指导临床治疗决策中, 对于EGFR突变NSCLC的MRD定义是否仍以任一ctDNA检出作为阳性标准是值得进一步推敲的。另一个需要考虑的则是克隆性造血的干扰, 研究提示超过50%的循环游离DNA（circulating free DNA, cfDNA）突变与克隆性造血相关, 而并非来源于肿瘤细胞突变[21]。因此, 当通过ctDNA检测进行肺癌MRD评估时, 其评估标准不能简单的一刀切, 需要综合考虑驱动分子事件、临床治疗因素以及分析筛选策略。
$\bullet$ MRD检测的基本技术, 包括肿瘤先验分析（tumor-informed assays, 个体化定制或NGS panel）和肿瘤未知分析（tumor-agnostic assays, NGS panel和多组学技术）, 目前均处在探索阶段, 需要前瞻性研究确定其敏感性、特异性和预测价值;
$\bullet$ 基于NGS的突变检测技术, 所选用的多基因panel中必须覆盖患者Ⅰ /Ⅱ 类基因变异, 基本技术标准是可稳定检测出丰度≥ 0.02%的ctDNA;
• $\bullet$ 驱动基因阳性的非小细胞肺癌, MRD的分子检测panel应包括其驱动基因;
$\bullet$ MRD评估报告中必须包括cfDNA浓度、ctDNA浓度及所检测基因VAF值;
$\bullet$ 需要建立针对免疫治疗的MRD标准
共识级别：2B。
目前对于肺癌MRD检测分析平台技术中主要有癌症个体化深度测序技术（cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq）以及在TRACERx研究中使用的Signatera或ArcherDx技术, 另外还包括TEC-Seq[22], CancerSEEK[23]及MRDetect[24]技术。而这些技术平台的研发策略主要分为两部分, 一是肿瘤先验方法（tumor-informed assays）, 即事先通过肿瘤组织标本测序获取其基因突变信息, 并依此制定个体化方案; 二是肿瘤未知方法（tumor-agnostic assays）即无需事先获得肿瘤基因变异信息, 通过固定的检测方案及分析策略进行MRD检测。目前, 国内外尚无获批针对肺癌的MRD产品; 而随着MRD临床应用价值逐步受到关注, 出现越来越多商业化MRD检测平台, 这可能会引起肺癌MRD研究的进一步混乱。以ctDNA为基础的MRD检测与常规ctDNA检测相比, 在检测技术及分析策略有着本质上的区别, 因此必须对其基本技术要求有所规范。
2016年, 美国分子病理协会（Association for Molecular Pathology, AMP）公布了关于肿瘤序列变异检测标准及报告共识[25]; 在此共识中, 根据诊断、预后及临床治疗的相关性, 对体细胞突变划分为四个级别：Ⅰ 类（有明确临床意义的, 如获批的或诊疗指南推荐的治疗靶点, 写入专家共识的疗效预测、耐药等位点）, Ⅱ 类（有潜在的临床意义的, 如研发中或小样本量研究提示的治疗靶点, 小样本量或存在争议的疗效预测、耐药等位点）, Ⅲ 类（临床意义不明的）及Ⅳ 类（良性或考虑良性的）; 2017年, 中国也公布了《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》, 里面对于基因变异同样有详细的分级描述[26]。因此, 无论是tumor-informed或tumor-agnostic的分析策略, 其检测对象应至少覆盖患者本身或NSCLC目前的所有Ⅰ /Ⅱ 类体细胞突变, 并且报告中必须详细描述其检测样本中cfDNA浓度、ctDNA浓度以及阳性基因的VAF值。
根据既往研究结果提示, 早期NSCLC患者血浆中位cfDNA浓度为7.69 ng/mL[27], 换算在10 mL血浆中含有则大概含有20 000个单倍体基因组（3.3 pg）; 考虑到cfDNA建库时的损耗以及至少存在2条相同的变异基因序列, 10 mL血浆中ctDNA检测到的极限分子信号即为0.02%的水平。另外, 从TRACERx研究数据推算, 在1 cm3体积的肿瘤情况下, 10 mL血浆中大概含有2条肿瘤来源DNA分子[28]。因此, 在NSCLC中进行MRD检测时, 该检测方法必须可稳定检测出丰度≥ 0.02%的ctDNA。
近年来, 免疫检查点抑制剂的应用改写了NSCLC的治疗格局。对正在进行免疫治疗的NSCLC患者进行MRD评估时需要考虑以下两点：第一, 免疫治疗期间影像学病灶的肿瘤残留问题, 尤其在假性进展上。既往报道提示NSCLC免疫治疗假性进展的发生率在5%左右[29, 30]。在黑色素瘤患者中动态ctDNA检测已证实可协助鉴别免疫治疗假性进展与真进展[31, 32], 而NSCLC中同样有类似的个案数据报道[33, 34]。因此针对NSCLC免疫治疗患者, 在体内残留可见病灶进行MRD检测时需考虑此情况; 第二, 从免疫细胞抗肿瘤生理机制上出发, 针对肿瘤新抗原进行MRD评估的意义值得进一步探索。Jia等一项研究中, 入组10例接受免疫检查点抑制剂治疗NSCLC患者, 通过全外显子测序分析并制定个体化新抗原检测, 结果显示相对于市面上商业化的ctDNA检测产品, 这一针对肿瘤新抗原定制化的检测思路能更有效地预测患者免疫治疗疗效变化[35]。因此, 对于免疫治疗患者进行MRD评估时, 其检测思路及标准或与其他治疗方式有所区别, 有待进一步探索验证。
$\bullet$ 早期非小细胞肺癌患者根治性切除术后, MRD阳性提示复发风险高, 需进行密切随访管理, 建议每3~6个月进行一次MRD检测;
$\bullet$ 建议基于MRD开展可手术非小细胞肺癌的围术期临床试验, 尽可能提供围术期精准治疗方案;
$\bullet$ 建议分别探索MRD在驱动基因阳性和驱动基因阴性两种类型患者中的作用
共识级别：2A。
$\bullet$ 局部晚期非小细胞肺癌根治性化放疗后完全缓解患者, 建议检测MRD, 有助于判断预后和制定进一步的治疗策略;
$\bullet$ 建议开展基于MRD的化放疗后巩固治疗的临床试验, 尽可能提供精准的巩固治疗方案
共识级别：2A。
2017年, TRACERx研究公布了其中24例NSCLC患者术后进行动态ctDNA追踪研究结果, 通过Signatera技术追踪外周血中个体化单核苷酸变异（single nucleotide variant, SNV, 中位数18个, 范围10~22个）[28]; 结果显示在14例判断为ctDNA阳性（至少2个SNV）的患者中13例患者出现临床疾病复发, 且ctDNA中位超前预判时间为70天（范围10~346天）。在2020年美国癌症研究协会年会（American Association for Cancer Research, AACR）上, TRACERx研究进一步公布了其后续78例病例结果, 通过ArcherDx检测技术（中位196个SNV, 范围72~482个）动态检测ctDNA, 结果显示其中45例疾病复发患者中37例可检测出ctDNA阳性, 其中位超前预判时间为151天; 而另外23例无复发患者中, 共199例血浆样本中仅检测出1例ctDNA阳性[36]。另一项研究中, Chaudhuri等通过CAPP-Seq技术动态追踪40例Ⅰ ~Ⅲ 期根治性治疗后NSCLC患者, 结果提示其中20例任一时间节点的ctDNA阳性患者全部经历疾病复发, 其中位超前预判时间为5.2个月[37]。因此, 从目前研究数据看, 基于ctDNA的MRD检测在预测早期NSCLC患者术后疾病复发已初露锋芒。
而目前对于MRD在疗效预测上仅有小样本量研究数据。在TRACERx研究中, 有3例术后ctDNA阳性患者接受辅助化疗后检测到的SNV数进行性升高, 而这3例患者全部在术后1年内复发; 相反, 有1例术后ctDNA阳性患者在经过辅助化疗后达到ctDNA清零, 而此患者在术后688天仍保持无复发状态[28]。在另一项CAPP-Seq研究中, 共入组65例接受根治性放化疗的局部晚期NSCLC患者, 其中28例患者进一步接受了免疫检查点抑制剂巩固治疗[38]; 在这项研究中, 根治性放化疗后ctDNA阴性的患者, 无论是否接受免疫巩固治疗, 两组患者的无进展生存期无统计学差异（P=0.23）, 相反在根治性放化疗后ctDNA阳性患者则可明显从免疫巩固治疗中获益（P=0.04）; 而且, 在免疫巩固治疗前期, 若ctDNA进行性升高, 患者同样无法从免疫检查点治疗中获益（P=0.47）[38]。
另一个值得关注的问题则是在NSCLC根治性治疗（如手术, 根治性放疗）后MRD监测起始的时间窗。手术创伤或放疗必将会引起机体系统性炎症反应及周围组织损伤, 对外周血循环背景存在一定的干扰。Chen等发起DYNAMIC研究, 通过术前、术后5分钟、30分钟、2小时、1天、3天、1个月等多个时间点连续采样, 最终入组可分析的26例早期接受根治性切除NSCLC患者, 分析得出ctDNA的半衰期大约在35分钟左右且患者术后3天的ctDNA状态即可提示其复发风险[39]。而两项CAPP-Seq研究中, 首次MRD检测时间窗都设定在根治性治疗后4个月内[37, 38]; 而如果局部晚期NSCLC接受根治性放化疗后准备接受免疫检查抑制剂巩固治疗的, MRD检测的时间窗则定为根治性放化疗后至少1周[38]。因此, 目前我们推荐MRD首次检测的时间窗在NSCLC根治性治疗后1周到1个月之内。
$\bullet$ 晚期非小细胞肺癌目前缺乏针对MRD的相关研究;
$\bullet$ 晚期非小细胞肺癌系统治疗后完全缓解患者, 建议检测MRD, 有助于判断预后和制定进一步的治疗策略;
$\bullet$ 建议在完全缓解患者中开展基于MRD的治疗策略研究, 尽可能延长完全缓解持续时间, 使患者能最大获益
共识级别：2A。
目前仍缺乏针对晚期NSCLC患者的MRD相关研究。而随着治疗手段越来越丰富, 晚期NSCLC患者生存期逐步得到延长。在KEYNOTE-010研究中程序性死亡配体1（programmed death ligand 1, PD-L1）表达≥ 50%的患者接受帕博利珠单抗的5年总生存率为25%, 而对应的多西他赛组仅8.2%; 完成35个周期或2年免疫治疗的79例患者中, 61例患者（77.2%）仍然存活, 3年的总生存率为83%[40]。而CheckMate017/057中, 二线治疗使用纳武利尤单抗的5年总生存率为13.4%[41]。另外, 在KEYNOTE-024研究中PD-L1表达≥ 50%患者中一线使用帕博利珠单抗, 其5年总生存率为31.9%, 中位总生存期为26.3个月[42]。而在靶向治疗上, 除了逐年涌现的新靶点外, 其总生存率也随着药物的研发更新而进一步提升。ALEX研究中阿来替尼一线治疗ALK融合NSCLC患者, 其5年总生存率为62.5%[43]; FLAURA研究中奥希替尼一线治疗EGFR突变人群, 3年的总生存率为53.7%, 且28%的人群仍接受治疗中[44]。看来MRD研究对这一部分长期生存的患者群体似乎来得意义更大。2020年, Hellmann等[45]进行了一项队列研究, 入组了31例在免疫检查点抑制剂长期获益的NSCLC患者, 其定义长期获益为无进展生存期超过1年; 通过CAPP-Seq技术检测外周血ctDNA发现, 其中4例ctDNA阳性患者全部复发, 而27例ctDNA阴性患者中25例仍未复发, 其自ctDNA检测起无事件生存期为16.9个月（范围4.8~24.2个月）, 总体上阳性预测值为100%, 阴性预测值为93%。因此, 以上的数据提示, 在部分NSCLC患者群体逐步实现了长期生存的目标前提下, 尤其体现在免疫治疗中“ 长、平” 的拖尾生存曲线上, 这部分长期生存的肺癌患者中MRD检测评估意义更为重大, 而这有待进一步临床试验探索。
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