HASMC购买于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）, 将HASMC培养于含10%哮喘患者血清（IgE总水平> 200 U/mL）的DMEM培养液中被动致敏24 h。本实验设置分组情况如下：实验组TRPC6阻断剂SKF96365处理的HASMC细胞; TRPC6 siRNA转染的HASMC细胞; TRPC6野生型的HASMC细胞。本研究主要实验材料如下：SYBR Green荧光染料, 兔多克隆TRPC6抗体, 山羊抗兔多克隆抗体, TRPC6上、下游引物, GAPDH上、下游引物, RIPA细胞组织裂解液, TRPC6阻断剂SKF96365, TRPC6 siRNA, 氚胸腺嘧啶核苷。

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应

利用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR）检测HASMC中TRPC6 mRNA的含量：（1）细胞总RNA的提取：总RNA提取过程需严格根据Trizol组织或细胞总RNA提取方法完成实验操作。（2）逆转录合成cDNA：按照逆转录试剂盒说明书各步骤严格操作, 进行cDNA的合成。荧光染料选择SYBR Green。根据引物设计原则设计的TRPC6引物序列如下：上游引物5′ -GCCAATGAGCATCTGGAAAT-3′ , 下游引物5′ -TGGAGTCACATCATGGGAGA-3′ 。内参基因磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH引物序列如下：上游引物5′ -ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′ , 下游引物5′ -GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′ 。（3）RT-PCR步骤：本实验选择的反应体系为40 μ L, 上游引物0.5 μ L, 下游引物0.5 μ L, DNA模板溶液1 μ L, 10× PCR缓冲液5 μ L, 浓度为2.5 mmol/L的dNTP 4 μ L, 浓度为25 mmol/L的MgCl₂ 4 μ L, 浓度为5× 10⁶U/L的Taq DNA 聚合酶0.5 μ L, SYBR Green荧光染料1 μ L, 最后用去除RNase的无菌水将体系补齐。上机检测时需将样品与阳性对照和空白对照同时检测, RT-PCR反应条件设置为95℃ 3 min, 92℃ 1 min, 60℃ 45 s, 72℃ 45 s, 一共循环35次。

1.2.2 Western blot 检测TRPC6蛋白的表达

利用western blot检测TRPC6蛋白在HASMC中表达：（1）总蛋白的提取：本研究通过RIPA细胞组织裂解液对细胞的总蛋白进行提取。蛋白裂解后, 加入适量的SDS loading buffer于100℃金属浴中煮样10 min, 置于冰上冷却后可进行SDS-PAGE电泳分离。（2）SDS-PAGE电泳：利用SDS-PAGE电泳将总蛋白进行分离, 浓缩胶电泳时电压设置为70~80 V, 待样品电泳至分离胶时, 可将电压调至120~130 V, 直至将蛋白样品彻底分离。（3）转膜：将SDS-PAGE凝胶上的蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上, 该过程采用湿转方式, 转膜参数设置为恒定电流300 mA, 时间为80 min。（4）封闭：将硝酸纤维素膜用5%的脱脂牛奶封闭, 目的是封闭非特异性抗原, 避免过多的非特异性显色。（5）一抗：根据marker剪下目标蛋白分子量大小的条带, 利用兔多克隆TRPC6抗体进行一抗的孵育, 条件为4℃过夜。（6）二抗：一抗孵育完毕后将条带用PBST缓冲液清洗3~5次, 然后采用含有ECL发光基团的山羊抗兔多克隆抗体即二抗进行孵育, 条件为室温1~2 h。（7）显色：将条带滴加适量ECL显影液后置于显影仪中进行条带显色。用Image J分析软件对目标条带进行分析, TRPC6的相对表达水平以TRPC6与内参蛋白GAPDH的比值计量。

1.2.3 细胞计数检测HASMC的增殖情况

将被动致敏的HASMC进行实验分组, 分为对照组和研究组, 每组含有相同的细胞个数。其中研究组使用不同浓度的TRPC6阻断剂SKF96365处理72 h, 浓度梯度选择5、10、15、20 μ mol/L, 该药物配制时的溶剂为二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）, 因此对照组使用相同体积的DMSO处理72 h。在药物处理的不同时间点（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）对每种条件下的细胞进行计数, 全部完成后制作细胞生长曲线。

1.2.4 TRPC6 siRNA的转染和氚胸腺嘧啶核苷掺入试验

除了利用TRPC6抑制剂来减少TRPC6的表达进而检测其对细胞增殖的影响外, 本研究还通过转染TRPC6 siRNA来沉默TRPC6。根据相关引物设计原则得出TRPC6 siRNA的正义链序列为5′ -TTCCCGCCATGAGCCAGA-3′ , 反义链序列为5′ -TCTGGCTCATGGCGGGAA-3′ 。根据碧云天的脂质体lipofectamine 3000转染试剂盒将TRPC6 siRNA严格根据操作流程转染HASMC, 转染时间为48 h, 然后通过western blot检测TRPC6蛋白的表达并利用氚胸腺嘧啶核苷掺入实验来检测其对细胞增殖的影响。

数据资料均通过SPSS 22.0软件完成数据统计学分析, 以P< 0.05表示对比差异存在统计学意义。计量数据通过“ x ± s” 形式表示, 比较行t检验; 计数数据比较行χ ²检验。

RT-PCR检测实验组和对照组中TRPC6 mRNA表达情况如图1所示, TRPC6 mRNA在HASMC中的表达量与SKF96365处理和TRPC6 siRNA转染相比显著升高（P< 0.001）, 差异具有统计学意义。

图1

Fig.1

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	图1 TRPC6 mRNA在HASMC中的相对表达情况 注：RT-PCR检测HASMC的TRPC6 mRNA的相对表达。* * * P< 0.001。每个条形图代表三个独立实验的平均值± SDFig.1 The expression of TRPC6 mRNA in HASMC Note：Relative expression of TRPC6 mRNA in HASMC as determined by RT-PCR. * * * P< 0.001. Each bar represents the mean ± SD of three independent experiments

利用细胞计数的方式对不同处理条件下的HASMC的增殖情况进行测定, 结果如图2、图3所示, TRPC6阻断剂SKF96365使TRPC6基因表达减少后, 细胞数目随着SKF96365浓度的升高而减少（P< 0.01）, 在单一浓度10 μ mol/L的作用下, 细胞数目随着SKF96365处理时间的延长增长速度缓慢（P< 0.01）, 同时通过TRPC6 siRNA转染使TRPC6敲除后细胞增殖明显减少, 表明TRPC6能够抑制被动致敏的HASMC的增殖和表达。

图2

Fig.2

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图2 SKF96365不同浓度对细胞增殖的影响 注：将HASMC培养于含不同浓度（0、5、10、15、20 μ mol/L） SKF96365的培养基中, 72 h后计数细胞数量。* * P< 0.01。每个条形图代表三个独立实验的平均值 ± SDFig.2 The effect of SKF96365 at different concentrations on HASMC proliferation Note： HASMC were cultured in medium containing different concentrations（0, 5, 10, 15, 20 μ mol/L） of SKF96365, then cells were counted after 72 h. * * P< 0.01. Each bar represents the mean ± SD of three independent experiments

图3

Fig.3

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图3 SKF96365、TRPC6 siRNA对细胞增殖的影响 注：分别在不同时间点（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）对正常HASMC、10 μ mol/LSKF96365处理HASMC和TRPC6 siRNA转染HASMC进行计数。每个条形图代表三个独立实验的平均值 ± SDFig.3 The effect of SKF96365 and TRPC6 siRNA on HASMC proliferation Note： Normal HASMC, HASMC treated with 10 μ mol/LSKF96365 and HASMC transfected with TRPC6 siRNA were counted at different time points （0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h）. Each bar represents the mean± SD of three independent experiments

Western blot检测TRPC6蛋白的表达结果如图4所示, TRPC6阻断剂SKF96365和TRPC6 siRNA转染均能够显著减少HASMC中TRPC6的表达。为了明确TRPC6影响HASMC增殖所涉及的相关分子机制, 应用western blot检测了对照组、siRNA敲减TRPC6组以及TRPC6阻断剂SKF96365组中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylin-ositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR）信号通路的表达情况, PI3K/Akt/mTOR信号通路能够促进包括人平滑肌在内的多种类型细胞增殖, 结果如图4所示, TRPC6阻断剂SKF96365和TRPC6 siRNA转染抑制了TRPC6的表达后, 均能够显著降低HASMC中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR的表达。

图4

Fig.4

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图4 SKF96365和TRPC6 siRNA处理后TRPC6蛋白及PI3K/Akt/mTOR通路分子的表达情况 注：TRPC6蛋白和PI3K/Akt/mTOR在正常HASMC、SKF96365处理HASMC和转染TRPC6 siRNA的HASMC中的相对表达及western blot定量分析。* P< 0.05; * * P< 0.01。每个条形图代表三个独立实验的平均值 ± SDFig.4 The expression of TRPC6 protein and PI3K/Akt/mTOR in normal HASMC, HASMC treated with SKF96365 and HASMC transfected with TRPC6 siRNA Note：Relative expression and quantitative analysis of western blot of TRPC6 protein and PI3K/Akt/mTOR in normal HASMC, HASMC treated with SKF96365 and HASMC transfected with TRPC6 siRNA. * P< 0.05; * * P< 0.01. Each bar represents the mean ± SD of three independent experiments

氚胸腺嘧啶核苷（tritium thymine nucleoside, 3H-TdR）掺入实验对TRPC6对HASMC细胞增殖的检测结果如图5所示, 10 μ mol/L的SKF96365处理72 h或TRPC6 siRNA转染细胞48 h后, 3H-TdR标记的细胞数量显著减少（P< 0.01）, 差异具有统计学意义。

图5

Fig.5

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图5 SKF96365和TRPC6 siRNA处理后3H-TdR掺入情况 555注：将3H-TdR加入正常HASMC、SKF96365处理HASMC和TRPC6 siRNA转染HASMC中, 10 mol/L SKF96365处理72 h和TRPC6 siRNA转染48 h后检测3H-TdR标记细胞数。* * P< 0.01。每个条形图代表三个独立实验的平均值 ± SDFig.5 The content of 3H-TdR in normal HASMC, HASMC treated with SKF96365 and HASMC transfected with TRPC6 siRNA Note：Tritium thymine nucleoside was added to normal HASMC, HASMC treated with SKF96365 and HASMC transfected with TRPC6 siRNA, then the number of 3H-TdR labeled cells was detected after 10 mol/L SKF96365 treatment for 72 h and TRPC6 siRNA transfection for 48 h. * * P< 0.01. Each bar represents the mean ± SD of three independent experiments