Ⅰ ~Ⅲ 期CRC术后辅助治疗既存在治疗不足又存在治疗过度：对于Ⅰ 期和低风险Ⅱ 期结肠癌不采用辅助化疗, 但有5%~10%的患者复发; 对具有高风险临床病理学特征的Ⅱ 期结肠癌患者实施辅助化疗, 复发风险为30%; 40%的Ⅲ 期结肠癌患者没有接受辅助化疗也可治愈, 30%的患者即使接受辅助化疗依然会复发。因此, 有必要更准确地预测Ⅱ 期和Ⅲ 期结肠癌中哪些患者对化疗可能获益, 应该加强治疗以免复发; 哪些患者对化疗可能不获益则尽可能避免化疗。

可切除的结直肠肝转移瘤（colorectal liver metastases, CRLM）患者术前ctDNA状态可以预测CRLM术后患者的复发风险。研究表明^{[7, 8]}血浆ctDNA水平与肿瘤负荷有关, 术前化疗期间ctDNA减少则肿瘤反应好, 术后和辅助化疗后ctDNA阳性则CRLM切除后RFS较短。Diehl等^[9]报道了ctDNA检测在20例CRLM患者接受部分肝切除术的预后价值, 其中16例术后ctDNA阳性患者除1例外全部复发, 而ctDNA阴性者则没有。Tie^[10]等发现CRLM患者中46/54（85%）患者治疗前都可以检测到ctDNA, 与术后ctDNA检测不到的患者相比, 术后ctDNA阳性者的RFS和总生存期（overall survival, OS）明显较低（P< 0.001）, 而且术后ctDNA阳性不论有无术后化疗则5年无复发生存率为0%, 而治疗结束ctDNA检测不到的患者5年无复发生存率高达75.6%（P< 0.001）。这表明在可切除的转移性结直肠癌（metastatic CRC, mCRC）中ctDNA检测可以指导选择合适的手术患者, 而术后ctDNA阳性也可以适当强化辅助治疗或换用新的全身药物治疗, 同时也需要更密切的术后复发监测。

不可切除的mCRC患者ctDNA检测可以指导更有效的系统性治疗。Garlan等^[11]观察到, 在开始一线或二线系统治疗前, 血浆ctDNA水平较高（> 10 ng/mL）的患者的OS为6.8个月, 明显低于水平较低（< 1 ng/mL）的患者的33.4个月（P< 0.000 1）。而在开始一线或二线系统治疗前ctDNA水平较低（< 0.1 ng/mL）并保持较低水平的患者, 以及在两个治疗周期后才变得较低的患者, 其无进展生存期（progression-free survival, PFS）均明显长于那些水平上升或没有下降到< 0.1 ng/mL的患者。

mCRC患者随着时间推移体内的分子异质性会导致对一线和后续治疗的抵抗。Wang等^[12]进行了一项前瞻性的观察性研究, 招募未接受全身治疗的mCRC患者, 并采用连续ctDNA检测来监测一线治疗期间体细胞变异, 并调查其与临床结果的潜在相关性。结果表明, ctDNA水平与一线治疗期间的肿瘤负荷呈正相关。此外, 基线时ctDNA水平中位数为14.0%, 显著高于145例患者在疾病进展（progression disease, PD）前最后一次活检时的0.5%（P< 0.001）, 表明经过一段时间的治疗后ctDNA水平显著下降。清除RAS或BRAF突变的患者mPFS明显优于保留RAS或BRAF突变患者; 清除RAS或BRAF突变的患者与保留RAS或BRAF野生型患者的mOS相似, 而维持RAS或BRAF突变的患者mOS分别缩短为14.5个月和11.4个月。因此, ctDNA连续检测可能有助于监测治疗效果及判断预后, 而且ctDNA可以追踪RAS克隆以监测耐药性或接受抗EGFR再挑战的潜力。

对于RAS野生型mCRC患者, 接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗后血浆中会出现继发性耐药突变, 导致耐药。在CO.26试验中对难治性mCRC患者（n=169）进行了抗EGFR治疗前组织全外显子测序（whole exome sequencing, WES）, 并与基线和第8周的ctDNA评估进行了比较^[13], 结果显示ctDNA检测到12个基因在抗EGFR治疗后突变频率增加, 包括EGFR、KRAS、LRP1B、ZNF217、MAP2K1、PIK3CG、BRAF和NRAS。获得性突变表现为多个并发的亚克隆改变, 多克隆耐药性是很常见的, 在既往接受过抗EGFR治疗的患者中, 有21%的患者获得了≥ 10个与耐药性有关的改变, 而没有接受过抗EGFR治疗的患者中只有5%（P=0.010）。因此, ctDNA能以无创的方式识别新出现的基因改变并追踪肿瘤的克隆演变, 与重复的肿瘤活检相比, ctDNA更便宜、更安全、更方便, 而且能更准确地反映耐药机制。

有趣的是, 大多数耐药突变表现为随时间推移而衰减, Parseghian等^[14]分析了135例以前接受过EGFR单抗治疗并PD的患者ctDNA检测结果, 通过数学建模来描述克隆的动态变化从而发现了RAS和EGFR克隆从最后一次EGFR单抗开始随时间衰减。发现RAS和EGFR的相对突变等位基因频率（relative mutant allele frequency, rMAF）与上次抗EGFR治疗后的时间呈反比关系。这些克隆呈指数型衰减, 累计半衰期为4.4个月, 单个RAS和EGFR等位基因的半衰期分别为3.4个月和6.9个月。因此, 这为停用EGFR单抗一段时间后的再次应用提供了一个合理的分子解释。这些RAS和EGFR克隆的半衰期可能有助于指导重新挑战疗法的时机, 并可通过ctDNA监测来实现。研究表明, 再挑战研究可以利用至少2个半衰期的EGFR单抗无治疗间隔, 大约8个月。而不同患者会表现出不同的动态变化, 因此, 连续的个体ctDNA监测可能是有更好的指导价值, 这需要前瞻性的临床试验进一步评估。

ctDNA检测可用于指导mCRC患者的三线治疗。CHRONOS研究^[15]是一项由ctDNA指导的抗EGFR治疗再挑战的多中心Ⅱ 期研究。在接受抗EGFR治疗的患者中, 如果ctDNA显示为野生型, 则先前对西妥昔单抗或帕尼单抗有反应并随后出现PD的患者有资格接受帕尼单抗的再次用药。在筛选的52例患者中, 36例（69%）符合ctDNA标准, 总有效率为30%, 疾病控制率为59%, 该研究达到了主要终点, 表明在三线治疗中帕尼单抗再挑战具有临床意义。CHRONOS研究结果表明对ctDNA进行及时的RAS评估可能更适合选择EGFR单抗再挑战的患者。

了解mCRC的动态进化和对一线治疗的耐药机制十分必要, 为此随机收集了CALGB/SWOG80405试验的血液标本进行了前瞻性-回顾性ctDNA分析^[16], 结果发现在61例接受EGFR单抗治疗的患者中, 只有4例（6.6%）患者出现了1个以上有意义的获得性基因组改变（acquired genomic alterations, Acq-GAs）, 而接受VEGF单抗治疗的患者为7例（10.1%）, 两组并无显著性差异; 在一线西妥昔单抗化疗中观察到的所有Acq-GAs发生率明显低于既往研究中EGFR单抗后线治疗患者（n=292）的发生率（6.6% vs. 62.0%）, 包括获得性KRAS突变等关键改变（0% vs. 44%）。Acq-GAs与EGFR单抗后线治疗的耐药性（RAS, BRAF和EGFR-外域突变; ERBB2和MET扩增）显著相关, 而很少发生在前期使用EGFR单抗联合化疗时, 表明存在不同的耐药机制。这些发现对mCRC患者特别是那些前期接受EGFR单抗联合化疗的患者, 用ctDNA指导EGFR单抗再挑战的时间和价值具有重要意义。目前尚不清楚对西妥昔单抗一线联合化疗产生耐药而未获得任何基因组改变的患者, 是否与那些在后续治疗中获得并失去这些基因组改变的患者有何不同, 或者诱导的表型可塑性将在多长时间内对后续EGFR单抗产生耐药。未来有必要加强对治疗过程中克隆进化研究以利优化治疗和开发有效的治疗方法。